臧素綱，陳鑫，韓霜，陳曦，周玉貴

(南通大學(xué)附屬東臺醫(yī)院檢驗科，江蘇 東臺 224200)

2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM）是由復(fù)雜的遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的一種糖代謝性疾病。胰島素分泌缺陷和胰島素抵抗是T2DM發(fā)病機制的兩個要素，不同患者其胰島素抵抗和胰島素分泌缺陷具有的重要性不同，同一患者在疾病進(jìn)展過程中兩者的相對重要性也可能發(fā)生變化[1]。T2DM患者的糖耐量可存在單純空腹血糖受損或（和）單純糖耐量受損，表現(xiàn)為單純空腹血糖升高(IFH)，或單純糖負(fù)荷后血糖升高(IPH)，或兩者同時升高(IFH/IPH)3種不同狀態(tài)[2-4]。

microRNAs是一類非編碼蛋白質(zhì)的并可參與基因轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的單鏈小分子RNA。目前，已研究發(fā)現(xiàn)作用機制相對明確的，與調(diào)節(jié)胰島素敏感性及胰島素抵抗形成相關(guān)的miRNAs有miR-125a、miR-103/107、miR-122、miR-126、miR-181、miR-29、miR-133a 等[5-8]。 本實驗應(yīng)用 poly(A)聚合酶加尾SYBR Green I實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測血清miR-103，探討其在2型糖尿病不同糖耐量模式及正常人間的表達(dá)差異和臨床應(yīng)用價值。

1 資料和方法

1.1 一般資料 收集2014年10月至2015年2月南通大學(xué)附屬東臺醫(yī)院測定空腹血糖和餐后2h血糖的糖尿病患者標(biāo)本，收集同期南通大學(xué)附屬東臺醫(yī)院體檢中心的健康體檢者作為正常對照組。本研究經(jīng)南通大學(xué)附屬東臺醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，且所有實驗對象均知情同意。實驗分組如下：

a．健康對照組（N組）該組均系本院健康體檢者，無糖尿病高危因素，無典型的2型糖尿病癥狀，空腹血糖＜6.1mmol/L，血總膽固醇＜5.17mmol/L，血甘油三酯＜1.70mmol/L，BMI指數(shù)＜24，無重大疾病既往史，其他實驗室及影像學(xué)檢查無異常發(fā)現(xiàn)。

b．空腹血糖升高組(i-IFG組)該組符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，空腹血糖FPG≥7.0mmol/L，且OGTT 2hPG＜11.1mmol/L，本組 FPG測定值為7.73±0.80mmol/L，2hPG 測定值為 9.25±1.24mmol/L，HbA1c%測定值為 6.8±1.0。

c.餐后血糖升高組(i-IGT組)該組符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，OGTT 2hPG≥11.1mmol/L，同時空腹血糖FPG＜7.0mmol/L，本組FPG測定值為6.42±0.59mmol/L，2hPG 測定值為 9.25±1.24mmol/L，HbA1c%測定值為 6.6±1.2。

d．空腹血糖及餐后血糖升高組 (IFG&IGT組)該組符合2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，空腹血糖FPG≥7.0mmol/L，且 OGTT 2hPG≥11.1mmol/L，本組 FPG測定值為9.23±2.51mmol/L，2hPG測定值為16.12±4.10mmol/L，HbA1c%測定值為 8.9±1.7。

1.2 儀器與試劑 日立7600全自動生化分析儀為日本日立公司生產(chǎn)，華臣MQ2000PT糖化血紅蛋白儀，Rotor-Gene Q實時熒光定量PCR分析儀生產(chǎn)廠家是德國凱杰 （QIAGEN）公司，miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control，miRNeasy Serum/Plasma Kit，miScript II RT Kit miScript SYBR Green PCR Kit和miScript Primer Assay皆為德國凱杰公司生產(chǎn)。擴增miR-103的引物是hsa-miR-103a-3p，其序列為 AGC AGC AUU GUA CAG GGC UAU GA，也為德國凱杰公司提供。

1.3 方法

1.3.1 總RNA的提取 ⑴變性裂解；⑵氯仿的抽提；⑶沉淀總RNA；⑷RNA酶變性處理；⑸沉淀總RNA；⑹清洗干燥硅膠膜；⑺洗提RNA。

1.3.2 RNA純度檢測

1.3.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)獲得cDNA ⑴將15μl逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)混合物分裝到各PCR反應(yīng)管中，再加入5μl模板RNA；⑵在PCR儀上設(shè)置逆轉(zhuǎn)錄條件37℃下孵育 60min，95℃下孵育 5min。

1.3.4 以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增反應(yīng) ⑴將18μl PCR反應(yīng)混合物加入各個PCR反應(yīng)管中，再加入2μl模板cDNA；⑵設(shè)置PCR反應(yīng)程序如下：預(yù)變性15min后按變性15sec、退火30sec及延伸30sec三個步驟設(shè)置40個循環(huán)；⑶開始PCR擴增反應(yīng)。

1.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 本課題采用C.elegansmiR-39的miRNA模擬物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，為絕對定量法。將標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣本同時進(jìn)行擴增，擴增后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度對應(yīng)的CT值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及待測樣本的CT值計算出該樣本的絕對含量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行，將Ct值轉(zhuǎn)換成拷貝數(shù)，經(jīng)方差齊性分析，拷貝數(shù)不滿足正態(tài)分布和方差齊性條件，故用Mann-Whitney U檢驗進(jìn)行組間比較。根據(jù)血清miR-103的表達(dá)量，繪制ROC曲線，評價兩種miRNAs的診斷效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計數(shù)資料以（±s）表示。

2 結(jié)果

2.1 總RNA抽提純度檢測的結(jié)果 經(jīng)過SMA1000微量紫外分光光度計測量，本研究所有標(biāo)本抽提RNA 溶液的A260/A280比值（1.906±0.089）在1.8-

2.1 范圍內(nèi)，表明RNA的純度較好，可以用于后續(xù)的實驗。

2.2 實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR擴增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線poly(A)聚合酶加尾法SYBR Green I實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法檢測血清miR-103，擴增曲線呈S型，標(biāo)準(zhǔn)曲線呈線性，見圖1。

圖1 miR-103擴增曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3 PCR擴增產(chǎn)物的熔解曲線 miR-103熔解曲線在（77.5±0.2）℃呈現(xiàn)單峰，無引物二聚體及其它非特異雜峰存在，表明PCR反應(yīng)參數(shù)合適，擴增產(chǎn)物特異性好，見圖2。

圖2 miR-103擴增產(chǎn)物的熔解曲線

2.4 血清中miR-103在四組人群標(biāo)本中的檢測結(jié)果 i-IFG組血清miR-103的表達(dá)水平均高于i-IGT組的表達(dá)水平 （P=0.001），i-IFG組血清miR-103的表達(dá)水平均高于IFG&IGT組的表達(dá)水平（P=0.001），i-IGT組血清 miR-103的表達(dá)水平均高于IFG&IGT組的表達(dá)水平（P=0.036），三個病例組血清miR-103表達(dá)水平和N組血清miR-103表達(dá)水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.015、P=0.046、P=0.001），見表 1。

2.5 miR-103在不同糖耐量模式的診斷效能 在IFG組，血清miR-103在ROC曲線下面積（AUC值）為0.733，診斷敏感性為80.0%，特異性為76.5%，；在IGT組，血清 miR-103在 ROC曲線下面積（AUC值）為0.626，診斷敏感性為64.7%，特異性為70.4；在IFG&IGT組，血清miR-103在ROC曲線下面積（AUC值）為0.768，診斷敏感性為88.2%，特異性為62.5%，見圖3。

表1 四組人群血清中miR-103表達(dá)水平的比較結(jié)果

圖3 miR-103診斷不同糖耐量模式的ROC曲線圖

3 討論

2型糖尿病患者的糖耐量可存在單純空腹血糖受損單純糖耐量受損，表現(xiàn)為3種不同空腹和餐后高血糖模式。i-IFG主要是由于肝臟胰島素敏感性下降、肝臟糖生成的增加、早期胰島素分泌不足和胰高血糖素分泌增加；i-IGT主要是由于外周胰島素抵抗，進(jìn)展性的胰島β細(xì)胞功能喪失以及葡萄糖依賴的促胰島素多肽分泌的減少和胰高血糖素的增加[2-4，9，10]。 目前主要是通過測定 FPG 和進(jìn)行OGTT試驗和糖化血紅蛋白等檢驗、檢測項目對不同糖耐量水平進(jìn)行鑒別診斷，但是這些檢測項目都不同程度存在對患者進(jìn)行多次采血和多次檢測的繁瑣，并且存在患者檢驗前的準(zhǔn)備、采血時間等質(zhì)量控制難以標(biāo)準(zhǔn)化的缺點。因此學(xué)術(shù)界探尋診斷2型糖尿病不同糖耐量水平相關(guān)的新型生物學(xué)檢測標(biāo)志物一直是個熱點。

Trajkovski等[11]進(jìn)行動物實驗時發(fā)現(xiàn)miR-103可以調(diào)節(jié)胰島素的敏感性，沉默miR-103可以改善糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性，miR-103被抑制后可以使miR-103靶基因Caveolin-1上調(diào)，繼而提高胰島素信號，降低脂肪組織的大小，增加胰島素刺激的糖攝取。

本實驗中miR-103在三個病例組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義 （P=0.015 0.046 0.001，P＜0.05），三個病例組間的比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.001 0.001 0.036，P＜0.05）。i-IFG 組的表達(dá)量高于N組，i-IGT組和IFG&IGT組低于N組，且三個病例組miR-103的表達(dá)量依次下降，出現(xiàn)這樣的結(jié)果可能是因為i-IFG組是空腹血糖異常，主要與胰島素靶器官肝臟調(diào)節(jié)血糖的功能有關(guān)，出現(xiàn)了胰島素敏感性下降和抵抗，而i-IGT組和IFG&IGT組都存在糖負(fù)荷后糖代謝異常，miR-103主要是通過胰島素外周靶器官脂肪組織和肌肉進(jìn)行調(diào)節(jié)糖負(fù)荷后的血糖水平，可能是調(diào)節(jié)的方式不一樣，與血糖代謝的負(fù)反饋有一定的關(guān)聯(lián)，也可能確定病例組時沒有考慮到未知的影響因素 （如病例的數(shù)量、病人的用藥情況及并發(fā)癥等因素），具體機制有待今后實驗進(jìn)一步的探討。ROC曲線下面積值在0.50～0.70時有較低準(zhǔn)確性，在0.70～0.90時有一定的準(zhǔn)確性，在0.90以上時有較高準(zhǔn)確性。本文i-IFG組血清miR-103在 ROC曲線下面積（AUC值）為0.733，IFG&IGT組血清miR-103在ROC曲線下面積分別為0.768，靈敏度比較高，提示miR-103在2型糖尿病診斷和不同糖耐量水平模式的鑒別診斷有一定的臨床價值，可以作為2型糖尿病治療用藥方案選擇的生物學(xué)標(biāo)志物，糖化血紅蛋白可以反映過去6～8周的平均血糖水平，是監(jiān)視血糖水平可靠的指標(biāo)[12]，但是它既受空腹血糖和餐后血糖水平共同影響，也與高血糖狀態(tài)的持續(xù)時間有關(guān)系，在2型糖尿病不同糖耐量水平的診斷和鑒別診斷的價值并不高，本實驗miR-103在這一層面上是有一定的優(yōu)勢，可以與糖化血紅蛋白的進(jìn)行聯(lián)合檢測，提高臨床應(yīng)用價值。4結(jié)論

血清miR-103在2型糖尿病不同糖耐量水平各分組中的表達(dá)情況是i-IFG組＞N組＞i-IGT組＞IFG&IGT組，miR-103在病例組與對照組的表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且各病例組間miR-103的表達(dá)水平的差異亦有統(tǒng)計學(xué)意義。血清miR-103可作為2型糖尿病不同糖耐量水平的新型生物學(xué)標(biāo)志物，對2型糖尿病和2型糖尿病不同糖耐量水平的診斷、鑒別及治療方案的選擇具有一定的臨床應(yīng)用價值。