姚 清，李潤成，卿任科，廖華媛，余興龍

（湖南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，湖南 長沙 410128）

豬鏈球菌（Streptococcus suis,SS）作為人畜共患病病原菌[1]，不僅能引起豬腦膜炎、心內(nèi)膜炎、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等，同時還能引起人患病。根據(jù)豬鏈球菌莢膜多糖抗原性的差異，已將豬鏈球菌分為33個血清型（1～31型，1/2型和 33型）[2]，以及一部分未定型菌株[3]。豬鏈球菌血清型分型調(diào)查是了解特定暴發(fā)流行病學，并監(jiān)測潛在危險菌株的最有效方法之一，同時也是疫苗研發(fā)和免疫的重要參考資料。

不同血清型豬鏈球菌菌株致病力存在差異，引起臨床發(fā)病的血清型也不同，因此在病豬及健康豬體內(nèi)的分布也存在差異[4]，其中豬鏈球菌2型作為優(yōu)勢血清型，分布范圍較廣，致病性也較強[4]。據(jù)相關(guān)報道，2003—2007年從中國病豬中除分離到優(yōu)勢血清型豬鏈球菌2型（43.2%）外，還分離到了3型（14.7%）、4型、8型、5型、7型和 1/2型（3.2%～6.4%），其中SS3主要與肺炎的感染有關(guān)[5]。從法國患病和病死豬中分離到的主要血清型為2型、1/2型、9型、7型和3型[6]。在丹麥，血清型2型（29%）、7型（17%）、3、4和 8型（9%～10%）是最常分離到的血清型[7]。日本主要流行菌株為2型（28.2%），其次為 7型（10.8%）、1/2型（8.4%）、3型（7.4%）和 4型（5.5%）[8]。而韓國分離到的最主要血清型為3型（29%）和 4型（21%）[9]。因此，不同地區(qū)之間，豬鏈球菌的流行情況不同，優(yōu)勢血清型也存在差異。

1 材料與方法

1.1 樣品

2015—2017年從湖南省部分豬場病豬群中收集疑似豬鏈球菌感染生豬的肺臟、關(guān)節(jié)、淋巴結(jié)、脾臟、腦組織、扁桃體、腹股溝淋巴結(jié)等臟器組織，共142份樣本。

1.2 主要試劑

巧克力培養(yǎng)瓊脂購于貝瑞特生物技術(shù)有限公司，DL 2 000 DNA Marker購于康為世紀生物科技有限公司，2×PCR Taq Mix、DNA提取試劑盒購于北京天恩澤基因科技有限公司。

1.3 引物合成

參考GenBank中登錄的豬鏈球菌9型莢膜多糖基因序列（登錄號為JX986798.1、BR001006.1、JF 273651.1、CP017142.1、CP015557.1、CP002644.1），設計豬鏈球菌9型引物，豬鏈球菌GDH鑒定引物參照文獻[10]，其他血清型鑒定引物參照文獻[11]，將引物送擎科生物技術(shù)有限公司合成。各引物信息見表1。

表1 豬鏈球菌各型引物信息

續(xù)表1 豬鏈球菌各型引物信息

1.4 細菌分離鑒定

（1）細菌分離與鏡檢用燒紅的手術(shù)刀片將病料表面消毒，然后剪取一小塊組織接種至巧克力營養(yǎng)瓊脂上，置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)12 h后，挑取菌落形態(tài)較小、灰白色、透明或草綠色溶血環(huán)的疑似單菌落于巧克力營養(yǎng)瓊脂上劃線培養(yǎng)16 h，然后進行涂片鏡檢。

（2）疑似鏈球菌的PCR鑒定取疑似鏈球菌培養(yǎng)物，按DNA提取試劑盒操作說明提取DNA作為模板，采用豬鏈球菌GDH通用引物進行PCR鑒定，鑒定為豬鏈球菌者再用各血清型的特異性引物分別進行血清型的鑒定。PCR反應體系均為20 μL，包含10 μL mix，7 μL 蒸餾水，引物 2 μL，DNA 模板 1 μL。PCR反應條件均按94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32個循環(huán)，72 ℃再次延伸7 min。PCR結(jié)束后1.0%瓊脂糖凝膠電泳，紫外線燈下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離鏡檢結(jié)果

于過夜培養(yǎng)巧克力營養(yǎng)瓊脂挑取疑似菌落增菌培養(yǎng)后進行革蘭氏染色涂片鏡檢，能夠觀察到兩個圓形結(jié)構(gòu)連成的紫色短鏈狀結(jié)構(gòu)和長鏈狀結(jié)構(gòu)，疑似菌株代表性鏡檢見圖1。

圖1 疑似豬鏈球菌菌株代表型鏡檢

2.2 豬鏈球菌的GDH通用引物鑒定結(jié)果

對從142份樣本分離的疑似鏈球菌。采用豬鏈球菌GDH引物進行PCR特異性擴增，結(jié)果共鑒定到豬鏈球菌GDH陽性菌株106株，代表性結(jié)果圖片見圖2。由圖2可見除8、11號樣本外，均擴增到了預期大?。?57 bp）的特異性條帶。

圖2 豬鏈球菌GDH基因檢測結(jié)果

2.3 豬鏈球菌各血清型鑒定

采用豬鏈球菌33個血清型引物對這106份陽性菌株進行PCR特異性擴增，各血清型部分鑒定結(jié)果見圖3。

圖3 豬鏈球菌各血清型PCR擴增結(jié)果

2015—2017年從湖南省部分豬場病豬群中采集肺臟、支氣管、關(guān)節(jié)、淋巴結(jié)、脾臟、腦組織、扁桃體等，分離到106株豬鏈球菌，優(yōu)勢血清型為2型（30.19%），其次為 7型（11.32%）、8型（9.43%）和 3型（6.60%）等，其中未定型菌株所占比例較大，達13.21%，具體見表2。

表2 豬鏈球菌分型情況

3 討論

2015—2017年從湖南省收集疑似豬鏈球菌感染病豬臟器142份，通過GDH基因的特異性PCR方法進行鑒定，共鑒定到豬鏈球菌菌株106株，分離率達 74.65%（106/142）。

通過CPS基因的特異性PCR方法進行豬鏈球菌分型鑒定，其中92株可以進行分型（分型率達86.79%），分別為 2型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、12型、16型、18型、19型、20型、21型、30型以及14株未定型菌株。優(yōu)勢血清型為2型（1/2型）30.19%，這與國內(nèi)外優(yōu)勢血清分離情況一致，說明2型分布范圍廣，致病性也較強，其次是7型（11.32%）、8型（9.43%）和3型（6.60%），這與國內(nèi)[5,12-14]以及國外[6-9]優(yōu)勢血清型的分離情況有一致性，但是未分離到1型菌株，且3型所占比例與國內(nèi)外分離情況相比偏低，這可能與空間、時間存在差異相關(guān)。

根據(jù)國家獸藥基礎數(shù)據(jù)庫最新發(fā)布的信息，截至2019年1月初，國內(nèi)已有6種商品化疫苗，分別為豬鏈球菌病滅活疫苗（馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型），豬鏈球菌病滅活疫苗（馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型+豬鏈球菌7型），豬鏈球菌病蜂膠滅活疫苗（馬鏈球菌獸疫亞種+豬鏈球菌2型），豬鏈球菌病滅活疫苗（2型，HA9801株），豬鏈球菌病、副豬嗜血桿菌病二聯(lián)疫苗（LT株+MD0322株+SH0165株），豬敗血型滅活疫苗（ST171株），主要是針對馬鏈球菌獸疫亞種和豬鏈球菌2型、7型。2015—2017年湖南省部分病豬群中豬鏈菌的優(yōu)勢血清型除了2型與7型外，8型和3型的感染也較多，且3型的感染與肺炎有關(guān)，值得引起重視，本試驗為今后豬鏈球菌疫苗的研究提供了參考數(shù)據(jù)。