蔣 遷 王平陽 譚靜霞 李亞萍 孟祥川 佟美金 趙巧玲，3

(1江蘇科技大學(xué)生物技術(shù)學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212018； 2廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)研究院，廣西南寧 530007；3中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所，江蘇鎮(zhèn)江 212018； 4廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，廣西南寧 530007)

昆蟲體表形形色色的斑紋在擬態(tài)、躲避傷害、吸引異性、調(diào)節(jié)體溫、免疫反應(yīng)、表皮硬化、覓食、抵御紫外線等[1-10]許多生理生化方面起重要作用，是昆蟲重要的生物學(xué)特征之一，同時也是昆蟲在自然選擇中能夠繁衍下來的因素之一[11]。為了生存，許多昆蟲擁有高度多樣化的體色模式，即使在同一物種中，也呈現(xiàn)出極其不同的顏色，如非洲白鳳蝶(Papiliodardanus)在一個簡單的控制體色的基因座上，就擁有十多個等位基因[12]。在已有報道中，同一個基因(基因座)能控制多種不同體色表型的現(xiàn)象是很少見的，相關(guān)研究報道也較少[13]，但是這類基因有助于對昆蟲色素沉積機(jī)制的研究。

家蠶(Bombyxmori)作為鱗翅目昆蟲的模式生物[14]，擁有許多色素型突變體，非常適合作為研究色素代謝與斑紋形成機(jī)制的材料[15-17]。家蠶普通斑主要由3種形狀的斑紋構(gòu)成，即眼狀紋、半月紋和星狀紋，它們是由同一個基因座p控制的[18]，而且將其定位到了第2連鎖群上遺傳距離大約3.0 cM的區(qū)間內(nèi)[19]，在這個基因座上，至少有15個等位基因，如素斑(plain，p)、極淡普通斑(lightest normal，pl)、普通斑(normal pattern，+p)、暗色蠶(moricaud，pM)、黑縞蠶(striped，pS)、腹條黑縞(ventral striped，pG)、黑色蠶(black，pB)、淡胸黑縞(whitish striped，pSw)、賽白斑(sable，pSa)、第2賽白斑(sable-2，pSa-2)等[18，20-22]。YODA等[23]通過圖位克隆和基因功能分析，發(fā)現(xiàn)apontic-like(apt-like)基因是控制p基因座相關(guān)性狀的關(guān)鍵基因，然后利用異位表達(dá)、RNA干涉(RNAi)、基因編輯(TELEN)等技術(shù)證明apt-like基因能引起細(xì)胞自主色素沉積，p基因座不同的著色模式是由于apt-like基因的表達(dá)水平不一樣誘導(dǎo)黑色素合成路徑上的基因表達(dá)量差異所引起的，其中pS是由于apt-like基因上發(fā)生單核苷酸多態(tài)性突變，引起1個氨基酸的替換，從而出現(xiàn)pS突變表型?？刂苝B突變體的主效基因pB是p基因座上另1個等位基因，pB突變體全身黝黑，各體節(jié)沿亞背線有若干白色波狀帶紋，屬于單基因顯性遺傳，且純合致死，采用雜合體保種[24]。

通過研究p基因座各等位基因的結(jié)構(gòu)變化與表達(dá)模式，將有助于進(jìn)一步研究apt-like基因在色素合成與斑紋形成中所扮演的角色，為昆蟲斑紋形成機(jī)制的研究做貢獻(xiàn)。本試驗(yàn)以pB突變體為研究對象，考察apt-like基因在pB突變體中的結(jié)構(gòu)和表達(dá)量是否發(fā)生變化，從而證明pB突變體是否和pS突變體一樣也是由于apt-like基因突變引起的，為進(jìn)一步研究pB突變體色素的沉積機(jī)制奠定基礎(chǔ)，也為apt-like基因的功能研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試家蠶品種 黑色蠶突變體pB(p/pB)由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所保存和提供，素蠶品種p(p/p)是從pB中分離而得，2個家蠶品種均在標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)，發(fā)育至5齡第3天時解剖頭部、表皮、中腸、血淋巴、卵巢、精巢、馬氏管、氣管、絲腺和脂肪體各組織備用。

1.1.2 主要試劑 DEPC(生物試劑)、瓊脂糖(生物試劑)、溴酚藍(lán)(生物染色劑)、蔗糖(生物試劑)、LB培養(yǎng)基(即用型粉劑，微生物用)和膠回收試劑盒，均為生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；RNA抽提液(RNAiso Plus)、DNase I、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)、熒光定量試劑盒[TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2×)]、蛋白酶K、RNase、DNA聚合酶(PrimeSTAR GXL DNA Polymerase和Ex Taq DNA Polymerase)、DL2000 DNA marker、dNTPs、T4 DNA連接酶和DH5α感受態(tài)細(xì)胞等試劑，均為寶生物工程(大連)有限公司(大連TaKaRa公司)產(chǎn)品；0.5 mol/L的EDTA(>99%，pH 為8.0)、3 mol/L的醋酸鈉(分析純，pH 為5.2)、冰醋酸(分析純)、無水乙醇(分析純)、75%的乙醇、10%的十二烷基硫酸鈉溶液(化學(xué)純)和氯仿(分析純)，均為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；1 mol/L的三羥甲基氨基甲烷[Tris(>99%，pH 為8.0)]和苯酚(>99%)，均為北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 TOMY SX-500型滅菌鍋、GNP-9080型恒溫培養(yǎng)箱，均為上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司產(chǎn)品；FRESCO 17型冷凍離心機(jī)、NANODROP1000型微量分光光度計(jì)，均為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；LightCycler?96實(shí)時熒光定量PCR儀，為上海羅氏制藥有限公司產(chǎn)品；G: BOX F3凝膠成像儀(SYNGENE)、2720 Thermal Cycle PCR儀，均為愛普拜斯應(yīng)用生物系統(tǒng)貿(mào)易(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試劑配制 DNA抽提液：取5 mL 1 mol/L，pH 為8.0的Tris，加入100 mL 0.5 mol/L，pH 為8.0的EDTA和25 mL 10%的十二烷基硫酸鈉溶液，加去離子水定容至500 mL，滅菌，4 ℃保存?zhèn)溆茫?0×TAE：稱取12.1 g Tris，量取2.85 mL冰醋酸和5 mL 0.5 mol/L，pH 為8.0的EDTA，加去離子水定容至50 mL，4 ℃保存?zhèn)溆茫?× Loading Buffer：稱取0.25 g溴酚藍(lán)和40.00 g蔗糖，加去離子水定容至100 mL。

1.2.2apt-like基因的編碼序列克隆 (1)黑色蠶pB、素蠶p的表皮組織提取總RNA。將表皮組織用液氮預(yù)冷的研缽研磨至粉末狀，加入RNAiso Plus繼續(xù)研磨至裂解液透明，將勻漿移入1.5 mL離心管中，然后參照RNAiso Plus說明書獲得總RNA。(2)cDNA合成?？俁NA測定濃度后，加入DNase I消化總RNA中殘留的基因組DNA，然后參照PrimeScriptTMRT Master Mix說明書合成cDNA，cDNA測定濃度以后稀釋至100 ng/μL。(3)apt-like基因的編碼序列克隆測序。以apt-like作為引物(表1)，pB和p的cDNA作為模板進(jìn)行RT-PCR，產(chǎn)物電泳并進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物連接T載體并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取菌斑搖菌并進(jìn)行PCR鑒定以后，送生工(上海)生物工程股份有限公司測序，測序結(jié)果進(jìn)行比對以獲得apt-like基因在2種家蠶中的編碼序列。

表1apt-like基因克隆、定量和內(nèi)參基因定量引物

引物名序列(5′→3′)作用apt-likeF: ATGTCAACGCGCAGTGCCR: TCATTTAGCGCTGGCCTTCTCapt-like基因編碼序列克隆apt-qPCRF: TATCGAACACGCCTTTGAACCTGR: CATTCGTGCTTTATGTGATCGTCCAapt-like基因?qū)崟r定量PCR分析apt-ge-nomeF: GGACGATCACATAAAGCACGAAR: TGAGTTTTGCAGCCATTACGAAapt-like基因第7外顯子在基因組水平的克隆GAPDHF: TTCATGCCACAACTGCTACAR: AGTCAGCTTGCCATTAAGAG實(shí)時定量PCR用內(nèi)參基因RPL3F: GAAGATGATCCGCTACTGTR: TATCCTTTGCCCTTGGTG實(shí)時定量PCR用內(nèi)參基因

GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；RPL3為核糖體蛋白L3。

1.2.3apt-like基因第7外顯子在基因組水平的克隆 (1)絲腺組織基因組DNA提取。將絲腺組織充分研磨后，加入0.6 mL的DNA 抽提液，冰上研磨，轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管，加入0.6 mL苯酚，充分混勻并離心，上清加入等體積的氯仿，充分混勻離心，上清加1/10體積的3 mol/L 醋酸鈉(pH為5.2)和2倍體積的無水乙醇，充分混勻并離心，用1 mL 75%的乙醇洗滌沉淀，室溫下風(fēng)干，加適量去離子水溶解，測定濃度后稀釋至100 ng/μL。(2)apt-like基因在基因組水平的克隆測序。參照“1.2.2apt-like基因的編碼序列克隆”(3)中的方法，以apt-genome為引物(表1)，基因組DNA作為模板對apt-like基因在基因組水平進(jìn)行克隆測序，測序結(jié)果進(jìn)行比對以獲得apt-like基因在2種家蠶中的最后1個外顯子序列。

1.2.4apt-like基因的組織表達(dá)分析 (1)黑色蠶pB、素蠶p的5齡第3天各組織總RNA提取。 參照“1.2.2apt-like基因的編碼序列克隆”(1)中的方法獲得黑色蠶pB和素蠶p的5齡第3天各組織總RNA。(2)cDNA合成。參照“1.2.2apt-like基因的編碼序列克隆”(2)中的方法合成cDNA，cDNA測定濃度以后稀釋至100 ng/μL。(3)apt-like基因的實(shí)時定量分析。以apt-qPCR作為定量引物(表1)，pB和p各組織的cDNA作為模板進(jìn)行qRT-PCR，以家蠶GAPDH和RPL3為內(nèi)參基因(引物見表1)，實(shí)時定量PCR反應(yīng)體系(20 μL)為cDNA模板1 μL，上下游引物(表1)各0.5 μL(10 μmol/L)，TB GreenTMPremix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，去離子水 8 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，隨后40個3步循環(huán)(95 ℃變性10 s，57 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s)，所得數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法[25]計(jì)算apt-like基因的相對表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 apt-like基因的編碼序列克隆

在pB和p中均獲得大約950 bp左右大小的條帶(圖1)，未出現(xiàn)顯著差異，進(jìn)一步對PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，結(jié)果表明apt-like基因編碼序列在pB和p中序列完全一致，并未出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的變異，與數(shù)據(jù)庫中的apt-like基因序列相比有4個堿基的替換，但是其翻譯的氨基酸序列完全一致，表明apt-like基因編碼序列在黑色蠶突變體pB中并未出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的變異。

1. apt-like基因編碼序列在素蠶p中的PCR產(chǎn)物，2. apt-like基因編碼序列在黑色蠶pB中的PCR產(chǎn)物，M.DL2000 DNA marker。圖1 家蠶apt-like基因編碼序列的克隆

2.2 apt-like基因在基因組水平的克隆

編碼序列克隆結(jié)果表明，apt-like基因在黑色蠶突變體pB和素蠶p中沒有出現(xiàn)結(jié)構(gòu)上的差異，且在黑縞蠶突變體pS中是apt-like基因的最后一個外顯子出現(xiàn)結(jié)構(gòu)變異，因此對黑色蠶突變體pB和素蠶p中apt-like基因的最后一個外顯子進(jìn)行克隆(圖2)，結(jié)果未出現(xiàn)顯著差異，進(jìn)一步測序結(jié)果表明apt-like基因的最后一個外顯子在pB和p中序列完全一致，進(jìn)一步證明黑色蠶突變體pB中apt-like基因未發(fā)生結(jié)構(gòu)變異，且由于黑色蠶突變體pB和黑縞蠶突變體pS突變位點(diǎn)不一樣，因此apt-like基因并未在最后一個外顯子出現(xiàn)單核苷酸多態(tài)性突變。

1. 基因組上apt-like基因最后一個外顯子在素蠶p中的PCR產(chǎn)物，2. 基因組上apt-like基因最后一個外顯子在黑色蠶突變體pB中的PCR產(chǎn)物，M. DL2000 DNA marker。圖2 家蠶apt-like的基因組鑒定PCR產(chǎn)物

2.3 apt-like基因的組織表達(dá)分析

經(jīng)過在mRNA和基因組水平對apt-like基因編碼序列進(jìn)行克隆測序，發(fā)現(xiàn)編碼序列在結(jié)構(gòu)上并未發(fā)生變化，于是利用實(shí)時定量PCR對apt-like基因的表達(dá)量進(jìn)行分析。分別用黑色蠶突變體pB和素蠶p的5齡第3天的表皮、頭部等10個組織器官進(jìn)行定量分析(圖3)。結(jié)果顯示,apt-like基因在表皮、頭部和中腸中表達(dá)量較高，除在血淋巴中表達(dá)量沒有顯著差異外，在其他9個組織中，apt-like基因的相對表達(dá)量均是素蠶p顯著或極顯著高于黑色蠶突變體pB(圖3)。除血淋巴外，黑色蠶突變體pB的其他組織apt-like基因與素蠶p相比都是顯著下調(diào)表達(dá)，其中在中腸、卵巢、氣管和脂肪體中下調(diào)倍數(shù)超過2倍。這些結(jié)果表明，在黑色蠶突變體pB中apt-like基因的表達(dá)量受到了顯著影響，可能在黑色蠶突變體pB突變性狀的形成中起作用。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。圖3 家蠶apt-like基因在黑色蠶突變體pB和素蠶p的5齡第3天各組織的相對表達(dá)量

3 討論

顯性遺傳是指同源染色體其中一個突變即可引起突變表型的遺傳模式，顯性純合或者雜合都表現(xiàn)為突變性狀，只有隱性純合時才表現(xiàn)出野生型性狀。在家蠶中也有許多顯性遺傳的突變體，楔形眼紋(Wes)是一種顯性遺傳，純合(Wes/Wes)致死，雜合(+/Wes)可以生存，表現(xiàn)出突變表型，該突變基因位于家蠶第6連鎖群上[26]。與Wes類似，短體蠶(Sq)[27]、竹蠶(Bo)[28]、裸蛹(Nd)[29]等都是顯性遺傳突變體。如果顯性突變純合致死(胚胎致死)，就要用雜合體作為突變體進(jìn)行研究，而雜合體有一半是正常野生型基因，為突變基因克隆帶來麻煩，當(dāng)突變基因因突變無法克隆時，雜合體往往都是克隆出了正常的基因，因此最好的辦法是用顯性純合的胚胎進(jìn)行克隆[30]。

黑色蠶突變體pB由于胚胎致死，使用未孵化蠶卵(大部分應(yīng)為純合致死)無法獲得足量可用的總RNA，可能正常蠶孵化后純合致死卵已經(jīng)死亡且內(nèi)容物降解，為此，在用雜合體進(jìn)行克隆時，加大了檢測樣本量(n>40)，在pB和p中未發(fā)現(xiàn)apt-like基因編碼序列有結(jié)構(gòu)差異，然而表達(dá)量檢測發(fā)現(xiàn)apt-like基因在pB和p之間有差異，且?guī)缀跛袡z測的組織(血淋巴除外)中apt-like基因在pB中的表達(dá)量相對于在p中的表達(dá)量顯著下調(diào)，而且在突變體pB(p/pB)中還有一半正?；?，暗示突變基因pB幾乎不表達(dá)，說明apt-like基因在黑色蠶突變體突變性狀的形成中是起作用的，而且有可能起了關(guān)鍵作用。

經(jīng)克隆測序，未發(fā)現(xiàn)apt-like基因編碼序列在pB(p/pB)中發(fā)生結(jié)構(gòu)變異，可能是由于發(fā)生突變的染色體出現(xiàn)了大片段的缺失、大片段的插入或者表達(dá)量極低等情況而導(dǎo)致PCR獲得的只是正常染色體的表達(dá)產(chǎn)物，也可能是由于發(fā)生突變的染色體上apt-like基因的編碼序列沒有發(fā)生結(jié)構(gòu)變異，而是非翻譯區(qū)或者啟動子發(fā)生了結(jié)構(gòu)變異。后續(xù)我們一方面將對apt-like基因的非翻譯區(qū)和啟動子進(jìn)行研究，另一方面還將嘗試使用顯性純合畸形胚胎克隆apt-like基因。