康越之，楊 濤，程翠翠，王 蕾，樊永平△

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)科，北京 100050；2.首都醫(yī)科大學附屬北京天壇醫(yī)院中醫(yī)腦病研究所，北京 100050；3.北京中醫(yī)藥大學附屬東直門醫(yī)院，北京 100700； 4.首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院，北京 100069)

圖3 小鼠腦組織透射電鏡結(jié)果

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)作為一種免疫介導的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)炎性神經(jīng)退行性病變，髓鞘損傷是其基本病理改變，髓鞘再生是多發(fā)性硬化的重要修復方式[1-2]。目前MS西醫(yī)治療以激素沖擊、免疫抑制治療為主[3]，由于副作用或價格因素，限制了其在MS治療中的應用。研究證明，中醫(yī)藥可以改善MS患者中醫(yī)癥狀評分、EDSS評分，減少復發(fā)率，緩解患者的炎性進程，調(diào)節(jié)免疫功能[4]?；贛S治療創(chuàng)立的補腎益髓膠囊(由熟地、酒大黃、炙水蛭、大貝母等藥物組成)，已獲北京市藥監(jiān)局醫(yī)院制劑批號(批號臨10003)。前期臨床及實驗研究證實，其治療MS/實驗性自身性免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)有效[5-8]。

補瀉兼施作為補腎益髓膠囊的根本立法，其在臨床急性期及緩解期均具有顯著療效。方中梓醇與大黃素分別是補藥與瀉藥的代表藥物地黃和大黃的重要有效成分。前期研究發(fā)現(xiàn)，補腎益髓膠囊及梓醇可以有效減輕CNS髓鞘脫失程度，還可明顯促進小鼠腦和脊髓中少突膠質(zhì)細胞前體細胞的增殖[8-9]。本研究基于補瀉單體相配伍(地黃有效成分-梓醇，大黃有效成分-大黃素)，利用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot，WB)、實時熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction，realtime rt-PCR)等方法檢測梓醇配伍大黃素在EAE小鼠大腦內(nèi)對神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白-1(neuregulin-1,NRG-1)表達的影響，探討梓醇、大黃素聯(lián)用對于髓鞘損傷修復的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6j雌鼠80只，6～8周齡，購自北京維通利華公司實驗動物中心(合格證號SCXK2012-0001)，飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學實驗動物中心(倫理批件AEEI-2014-018)。

1.2 藥品及試劑

梓醇(貨號2415-24-9，純度>95%)、大黃素(貨號518-82-1，純度>95%)購自中國食品藥品檢定研究院；醋酸潑尼松(Prednisone Acetate，PA)購自天津太平洋制藥有限公司(批號160337)；MOG35-55(純度>95%)由北京康為世紀生物科技有限公司合成；完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant，CFA)、(貨號F5882)、百日咳毒素(pertussis toxin，PTx)、(貨號P7209)、滅活結(jié)合分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis，TB)(貨號231145)均購自Sigma公司；NRG1單克隆抗體(貨號NB53104)購自美國Abcam公司。

1.3 EAE模型制備

將C57BL/6j小鼠按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、激素組、配伍組(EAE+C+E)每組各20只。于背部脊柱旁4點注射抗原乳劑，其由250μg MOG35-55、0.8 mg TB、100 μl CFA、100 μl生理鹽水配制而成，免疫當天(第0天)及48 h(第2天)后分別腹腔注射PTx 500 ng/只，誘導產(chǎn)生EAE。

1.4 動物給藥及處理方法

從免疫當天開始腹腔注射給藥，時間為8∶30～10∶30 am，配伍組的梓醇和大黃素分別給予40 mg/kg和1 mg/kg治療，激素組在外觀行為改變后給予PA 6 mg/kg治療，直至40 d結(jié)束。正常組及模型組生理鹽水代替。

1.5 動物行為學觀察

自免疫當天開始評價小鼠神經(jīng)功能。應用Kono5分法(0分：不發(fā)??；1分：尾巴乏力脫垂行走；2分：后肢乏力或單側(cè)后肢拖曳行走；3分為嚴重后肢麻痹或兩側(cè)后肢拖曳行走；4分為四肢麻痹；5分為瀕臨死亡或死亡)。

1.6 取材及觀察

在發(fā)病高峰期(第18天)及發(fā)病緩解期(第40天)取小鼠大腦組織，每組4只多聚甲醛灌注內(nèi)固定。常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色。每組4只新鮮取材后-80 ℃保存(40 d模型組死亡1只，共3只)。

1.7 透射電子顯微鏡觀察軸突髓鞘

取出標本，PBS液沖洗3次后1%鋨酸固定，酒精脫水，丙酮處理20 min，用包埋劑與丙酮浸透處理后再用純包埋劑包埋，70 ℃加熱過夜，即得包埋好的樣品。超薄切片機切片然后染色、鍍膜，透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)觀察小鼠大腦組織髓鞘脫散、軸突改變情況。

1.8 realtime rt-PCR方法檢測NRG1基因水平

NRG1 mRNA水平檢測：采用realtime rt-PCR法檢測mRNA水平。標本經(jīng)處理提取組織總RNA，進行反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR反應，以GAPDH為內(nèi)參照，采用2-△△CT法比較各組NRG1在mRNA層面表達變化。NRG1中mRNA的引物序列為：上游引物：GACCCAGGAGTATGAGCCAAT，下游引物：TTGCTGTCCATTTCCAACCTAT，北京Invitrogen公司合成上述引物。

1.9 westernblot方法檢測NRG1蛋白水平

取50 mg組織使用總蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)，經(jīng)BCA蛋白濃度測定試劑盒測定后制備蛋白樣品，12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離NRG1，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉后加兔抗鼠NRG1單克隆抗體(1∶600)，GAPDH(1∶600)，4 ℃過夜洗膜，二抗山羊抗小鼠IgG(H+L)(1∶10000)室溫孵育1 h，洗膜加入DAB顯色1 min，暗室曝光顯影，凝膠成像分析系統(tǒng)攝像分析掃描，以GAPDH作為內(nèi)參進行半定量分析。

1.10 統(tǒng)計學方法

注：Normal：正常組，EAE：模型組，EAE+PA：激素組，EAE+C+E：配伍組(*P<0.05，**P<0.01)圖1 小鼠神經(jīng)功能評分比較

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分變化

圖1顯示，各實驗組小鼠自造模第8天開始陸續(xù)起病，模型組小鼠于第15天神經(jīng)功能評分達到最高2.5分。自第16天至39天，激素組小鼠神經(jīng)功能評分較模型組顯著降低(P<0.05或P<0.01)，配伍組在免疫后第21天、27天至39天與模型組比較評分明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。

2.2 各組中大腦組織的病理學改變

圖2顯示，模型組及各治療組在高峰期均有大量炎癥細胞浸潤，形成袖套樣改變，緩解期出現(xiàn)部分神經(jīng)細胞核固縮。各干預組經(jīng)治療后較模型組明顯減輕。

2.3 TEM

圖3TEM顯示，正常組大腦內(nèi)髓鞘排列整齊緊密，薄厚均勻一致，結(jié)構(gòu)清晰(A1、A2)。急性期模型組小鼠髓鞘環(huán)形層狀結(jié)構(gòu)松散變形，部分髓鞘斷裂、崩解、脫失及融合，髓鞘及軸突板層分離，結(jié)構(gòu)紊亂(B1)。緩解期可見髓鞘再生，表現(xiàn)為軸突粗而髓鞘較薄較短(B2)。各治療組髓鞘環(huán)形層狀結(jié)構(gòu)松散變形程度較模型組減輕，可見新生的少突膠質(zhì)細胞(C1-2、D1-2)。

注：A1-D1為第18天小鼠，A2-D2為第40天小鼠。Normal：正常組；EAE：模型組；EAE+PA：激素組；EAE+C+E：配伍組(標尺：2.0 μm)

注：Normal：正常組；EAE：模型組；EAE+PA：激素組；EAE+C+E：配伍組(標尺：2.0 μm)圖4 第18天及第40天小鼠各組NRG1蛋白表達量比較

2.4 NRG1的蛋白及mRNA表達量發(fā)病高峰期(第18天)配伍組NRG1蛋白表達較之模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。發(fā)病緩解期(第40天)，激素組及配伍組NRG1蛋白表達較正常組、模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖4表1顯示，發(fā)病高峰期(第18天)配伍組NRG1 mRNA表達較之模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。發(fā)病緩解期(第40天)，激素組及配伍組NRG1 mRNA表達較正常組、模型組明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其余比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表1 第18天及第40天小鼠各組NRG1蛋白及mRNA表達分析比較

注：與正常組比較:*P<0.05；與模型組比較:#P<0.05

3 討論

MS屬于中醫(yī)“痿證”范疇，而肝腎陰虛和痰瘀的病理機制在多發(fā)性硬化患者中具有廣泛的代表性。前期研究證實，補腎化痰活血法/補腎益髓膠囊治療MS/EAE的過程中具有良好的療效，可以明顯緩解MS患者中醫(yī)癥狀評分、EDSS評分，調(diào)節(jié)患者外周血的免疫；減輕EAE神經(jīng)功能缺損，緩解髓鞘及軸突的損傷，提高EAE血清TGF-β水平，下調(diào)IFN-γ、MMP-9水平，改善CD4+/CD8+比值[10]，對EAE模型具有顯著的神經(jīng)保護和免疫調(diào)節(jié)功能。

前期研究發(fā)現(xiàn)，作為補腎藥物地黃的重要活性單體-梓醇可以明顯緩解EAE小鼠發(fā)病，減輕神經(jīng)功能缺損，可以通過增加Olig1/2基因及蛋白的表達，促進少突膠質(zhì)細胞前體細胞(oligodendrocyte precursor cell,OPC)增殖及分化[11]。研究證實，大黃素具有腦保護作用，可以通過影響Na+-K+AT酶等離子通道，促進細胞外水平衡，減輕腦水腫。同時，大黃素可以作用于L型鈣離子通道，抑制炎癥作用及纖維化作用，調(diào)節(jié)血脂異常糖尿病大鼠[12]。本實驗結(jié)果顯示，梓醇配伍大黃素可延長EAE小鼠外觀行為改變潛伏期，減少外觀行為改變率、降低死亡率，并可改善EAE小鼠外觀行為改變后尾部及肢體癱瘓、行走不便等神經(jīng)癥狀，降低EAE小鼠神經(jīng)功能評分。本實驗中H&E染色結(jié)果顯示，在模型組中可見大量炎性細胞浸潤，而各治療組均可不同程度的緩解，說明梓醇配伍大黃素能減輕小鼠炎癥反應，從而緩解由EAE帶來的炎癥損傷。透射電鏡下見模型組髓鞘環(huán)形層狀結(jié)構(gòu)松散變形、崩解、脫失及融合，而配伍組髓鞘環(huán)形結(jié)構(gòu)松散變形程度較模型組減輕，梓醇配伍大黃素對髓鞘具有一定的保護作用。

realtime rt-PCR及WB結(jié)果提示，配伍組可明顯提高NRG1基因及蛋白層面的表達，NRG-1作為含有表皮樣生長因子(epidermal growth factor,EGF)樣結(jié)構(gòu)域的細胞黏附分子，對髓鞘的再生具有重要作用[13]。其作用機制主要有，一是使軸突表面trkB受體經(jīng)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)激活，引起I或II型NRG-1的釋放，作用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞前體細胞，促使神經(jīng)膠質(zhì)前體細胞向神經(jīng)膠質(zhì)細胞發(fā)育。同時NRG-1正反饋于腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進其釋放，對少突膠質(zhì)細胞形成的微環(huán)境具有正向調(diào)節(jié)作用；二是NRG1可以直接作用于少突膠質(zhì)細胞，增強和維持少突膠質(zhì)細胞生長，抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的有絲分裂并誘導少突膠質(zhì)細胞分化[14]；三是NRG-1作為少突膠質(zhì)細胞的有效促分裂源和存活因子，促進OPC的增殖和存活[15]。本研究證實，梓醇配伍大黃素可以促進NRG1在基因及蛋白層面的表達，而NRG1具有上述促髓鞘再生的功能，從側(cè)面說明兩者配伍能夠改善少突膠質(zhì)細胞再生的微環(huán)境，減輕EAE神經(jīng)的損傷促進修復。

綜上所述，梓醇配伍大黃素可以減輕EAE小鼠大腦內(nèi)的炎性損傷，調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的微環(huán)境，促進腦內(nèi)NRG1的基因及蛋白表達，進而對髓鞘的再生具有一定的促進作用。