黃婷婷，郝冬琳，吳波娜，毛倫林，張金

作者單位：江蘇大學附屬武進人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，江蘇 常州 213002

帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是一種常見的神經(jīng)變性疾病，主要臨床表現(xiàn)是運動障礙，包括靜止性震顫、肌強直和運動遲緩。PD的病理特征是黑質(zhì)和紋狀體多巴胺能神經(jīng)元丟失。氧化應激和神經(jīng)炎癥是PD主要的發(fā)病機制，可能參與了多巴胺能神經(jīng)元的損傷[1-2]。由于1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)通過誘導活性氧和炎癥反應，選擇性損傷多巴胺能神經(jīng)元，使得MPTP注射動物制成的PD動物模型成為廣泛應用的PD動物模型[3]。目前多巴胺替代治療只能緩解癥狀，但不能阻止神經(jīng)變性過程。長期使用會產(chǎn)生運動障礙等并發(fā)癥[4]。因此，尋找有效的神經(jīng)保護劑并探索多巴胺能神經(jīng)元丟失的機制，仍然是PD治療的重要挑戰(zhàn)。

尿酸是飲食嘌呤或核酸降解的最終產(chǎn)品。高尿酸水平與多種疾病有關(guān)，包括高血壓、動脈粥樣硬化、高脂血癥和胰島素抵抗[5]。尿酸是一種強抗氧化分子，對某些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病具有保護作用。與健康對照相比，PD病人的血清和黑質(zhì)尿酸水平顯著降低[6-7]。因此，我們推測尿酸的抗氧化特性可能對PD的多巴胺能神經(jīng)元具有保護作用。

本研究自2015年5月至2017年5月應用MPTP誘導PD小鼠，并觀察尿酸的神經(jīng)保護作用以及尿酸對氧化應激和神經(jīng)炎癥的調(diào)控。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑尿酸和MPTP購自美國Sigma-Aldrich公司，并在鹽水中溶解。給藥前，尿酸溶液通過2.2 mm無菌過濾器進行純化。兔抗小鼠酪氨酸羥化酶(TH)抗體(目錄號t8700)購自美國Milipore公司?？贵wNrf2(目錄號12721p)購自美國細胞信號技術(shù)公司。

1.2 動物雄性C57BL/6J小鼠(6～8周、20～25 g)30只，購自上海斯萊克實驗動物有限公司。小鼠飼養(yǎng)于SPF條件、恒溫(21±1)℃及自動12 h/12 h的光暗循環(huán)。所有的動物研究均由江蘇大學附屬武進醫(yī)院動物倫理委員會批準。

1.3 分組采用隨機數(shù)字表法將30只小鼠分為三組：對照組(生理鹽水)、MPTP組、尿酸組(尿酸+MPTP)，每組各10只。MPTP組小鼠經(jīng)腹腔注射MPTP(20 mg/kg)每天1次，連續(xù)7 d。尿酸組于MPTP給藥之前2 h腹腔注射尿酸(250 mg/kg)，共13 d(MPTP注射前3 d，MPTP注射同時的7 d，MPTP結(jié)束后3 d)。對照組接受0.9%生理鹽水代替MPTP和尿酸。在第14天測量各組小鼠的行為和認知功能，然后殺死小鼠獲取腦組織進行進一步的分析。

1.4 行為學測量(1)轉(zhuǎn)棒試驗：將小鼠置于直徑7 cm的旋轉(zhuǎn)圓棒上，調(diào)整轉(zhuǎn)棒速度為30周/分。記錄小鼠被置于棒上至墜落的時間(跌落潛伏期)，每只動物重復測3次，每次間隔5 min，取平均值。測試前每只動物均進行兩次適應性訓練。(2)爬桿試驗：將小鼠頭端向下置于桿頂，記錄小鼠由60 cm高度爬至桿底平面的時間(爬下時間)，每只動物測3次，每次間隔5 min。測試前引導小鼠自桿頂爬下至桿底兩次進行適應。

1.5 認知功能測量應用Morris水迷宮試驗測定小鼠空間學習記憶能力，包括定位導航試驗和空間探索試驗。定位導航試驗：一個透明平臺放置在4個象限中的1/2個半徑內(nèi)，水面高于平臺頂部1 cm。小鼠被放置在遠離平臺的相對象限，允許它找到并爬上平臺。每只小鼠發(fā)現(xiàn)并爬上平臺的時間被記錄為逃避潛伏期，并從4個象限的試驗結(jié)果得到平均值。如果小鼠沒有找到平臺，逃避潛伏期記為60 s，空間探索試驗：從水池中移去上面的平臺，小鼠被置于前一個測試的對面象限的水中。觀察每只小鼠的游泳路徑60 s，記錄小鼠越過原平臺位置的次數(shù)。

1.6 免疫熒光染色行為學測試后，小鼠以4%水合氯醛，0.9%生理鹽水灌注15 min麻醉，采用多聚甲醛(4%)在0.1 mol/L PBS(pH 7.4)中固定20 min，收集大腦組織，多聚甲醛4℃固定過夜后，30%蔗糖在4℃保存72 h。用冷凍切片機把大腦切成20 μm連續(xù)冠狀切片。然后將切片保存在0.1 mol/L的PBS中，用3%BSA和0.3%的Triton室溫孵育2 h封閉抗原。PBS洗滌后，切片用兔抗小鼠TH抗體(1∶400)4℃孵育24 h，用Alexa Fluor 488處理標記的羊抗兔IgG(1∶400)室溫暗處孵育2 h。洗滌后，用激光共聚焦熒光顯微鏡對切片進行成像，計數(shù)TH陽性神經(jīng)元數(shù)。

1.7 紋狀體多巴胺水平分離小鼠兩側(cè)紋狀體，在超聲波破碎均質(zhì)化，4 ℃離心10 000g×10 min。分離上清液(10 μL)并注入裝有電化學檢測器的高效液相色譜系統(tǒng)(Milford、MA，美國)，以0.8 mL/min流速測量多巴胺含量。

1.8 實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)小鼠于第7天和第14天處死，取黑質(zhì)組織并置于無RNase離心管，存儲在-80 ℃。采用Trizol試劑提取總RNA 并用Superscript III酶逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。靶基因的mRNA的表達用SYBR Green PCR試劑盒 (TaKaRa,日本)和Real-time PCR 系統(tǒng) (Applied Biosystems,美國)。PCR反應條件如下：95 ℃ 5 min，60 ℃ 20 s，40個擴增循環(huán)。管家基因β-actin作為內(nèi)對照。PCR引物序列：Nrf2，正向：5’-TCTTGGAGTAAGTCGAGAAGTGT-3’；反向：5’-GTTGAAACTGAGCGAAAAAGGC-3’。γ-GCLC，正向：5’-GGGGTGACGAGGTGGAGTA-3”；反向：5’-GTTGGGGTTTGTCCTCTCCC-3’。HO-1，正向：5’-AAGCCGAGAATGCTGAGTTCA-3’；反向：5’-GCCGTGTAGATATGGTACAAGGA-3’。NQO1，正向：5’-ATGGGAGGTGGTCGAATCTGA-3’；反向：5’-GCCTTCCTTATACGCCAGAGATG-3’。

1.9 免疫印跡(Western blot)小鼠于第7天和第14天處死，取黑質(zhì)組織用RIPA裂解液和蛋白酶抑制劑處理30 min。蛋白質(zhì)樣品(50 μg)由8%的SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜，并用5%脫脂牛奶封閉抗原。膜與兔抗小鼠Nrf2抗體(1∶200)4℃孵育過夜。0.1%TBST洗滌3次后，該膜與辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔第二抗體(1∶10 000)在室溫下孵育1 h?？乖贵w復合物用增強化學發(fā)光法(ECL Amersham生命科學、英國)檢測。

1.10 氧化應激活性評估取小鼠中腦組織并制備勻漿，通過4 ℃離心10 000g×10 min分離上清液。用分光光度法測定試劑盒(南京建成生物工程研究所，南京，中國)測量氧化應激蛋白含量。用酶標儀(ricso rk201，深圳瑞科索科技有限公司，深圳，中國)測定超氧化物歧化酶，(SOD，560 nm吸光度)，過氧化氫酶(CAT，405 nm)，還原型谷胱甘肽(GSH，420 nm)和丙二醛(MDA，532 nm)。

1.11 免疫組織化學染色小鼠以4%水合氯醛麻醉，取海馬組織4%多聚甲醛固定過夜。脫水后，海馬組織用石蠟包埋制作連續(xù)切片(5 μm厚)。切片進行脫蠟脫水，用3%過氧化氫孵育滅活內(nèi)源過氧化物酶。切片3% BSA處理1 h，然后用兔抗小鼠IL-1β(1∶100)4℃孵育過夜。PBS洗兩次后，切片用山羊抗兔IgG抗體(生物素化酶-1∶100)在室溫下孵育2 h，用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)著色，并用蘇木精復染。Olympus BX51顯微鏡(奧林巴斯公司，日本)觀察并計數(shù)IL-1β陽性神經(jīng)元，選擇隨機5個視野計數(shù)計算細胞密度(細胞數(shù)/HP)。

1.12 血清細胞因子分析術(shù)后14 d取小鼠海馬和血清標本。通過4 ℃離心10 000g×10 min分離制備海馬勻漿上清液和血清，樣本存儲在-80 ℃。用ELISA法檢測IL-1β、IL-6和TNF-α水平(R&D Systems公司，美國)，用酶標儀測量450 nm處的光密度(OD)值。至少重復試驗3次。

2 結(jié)果

2.1 尿酸改善MPTP誘導的行為和認知功能障礙我們首先研究尿酸對PD小鼠運動功能的影響。尿酸處理(250 mg/kg)延長MPTP小鼠的跌落潛伏期，縮短爬下時間(圖1A，1B)。這些結(jié)果表明尿酸對MPTP誘導的運動平衡缺陷有改善作用。

我們還進行了Morris水迷宮試驗評價PD小鼠的認知功能。尿酸縮短了小鼠逃避潛伏期，增加穿越平臺次數(shù)(P<0.05)(圖1C，1D)。這表明MPTP對小鼠的空間學習和記憶有明顯的損害，但尿酸處理可減輕這種損傷。

2.2 尿酸MPTP誘導的PD小鼠具有神經(jīng)保護作用我們應用免疫熒光染色來觀察MPTP小鼠多巴胺能神經(jīng)元。熒光圖顯示了對照組、MPTP組和尿酸組黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元(圖2A、B、C)。定量數(shù)據(jù)表明，與對照組相比，MPTP小鼠TH陽性神經(jīng)元減少，這種減少能被尿酸處理部分緩解(圖2D)。我們還測量了紋狀體多巴胺含量。與對照組相比，MPTP小鼠紋狀體多巴胺含量顯著下降。尿酸增加MPTP處理小鼠的多巴胺含量(圖2E)。這些數(shù)據(jù)表明尿酸對PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元具有有效的神經(jīng)保護作用。

2.3 尿酸激活Nrf2-ARE通路并抑制氧化應激我們進行熒光定量PCR檢測抗氧化分子Nrf2的mRNA表達。與對照組相比，MPTP小鼠黑質(zhì)Nrf2 mRNA水平明顯下降，而尿酸顯著增加Nrf2的轉(zhuǎn)錄表達(圖3A)。此外，相比尿酸處理第7 天，第14天小鼠的Nrf2的mRNA水平明顯更高。然后我們分析了Nrf2的靶基因mRNA的表達。和MPTP組相比，尿酸處理7 d和14 d均顯著上調(diào)γ-GCLC、HO-1和NQO1的mRNA表達(圖3B、C、D)。

為了進一步研究尿酸對氧化應激的影響，我們測定了PD小鼠中腦組織的氧化應激蛋白含量。MPTP小鼠SOD、CAT和GSH含量顯著降低，提示MPTP可能破壞中腦抗氧化防御系統(tǒng)。然而尿酸處理顯著升高SOD、CAT和GSH含量(圖4A、B、C)。MPTP升高小鼠中腦MDA含量，而尿酸降低MDA含量(圖4D)。綜上所述，尿酸對MPTP誘導的PD小鼠的中腦組織具有抗氧化作用。

2.4 尿酸抑制神經(jīng)炎癥反應并降低炎性細胞因子表達為了探討尿酸對PD小鼠炎癥反應的影響，我們測量了小鼠海馬IL-1β蛋白的表達。免疫組化顯示了對照組、MPTP組和尿酸組海馬區(qū)IL-1β陽性神經(jīng)元(圖5A、B、C)。定量分析表明，與對照組小鼠相比，MPTP小鼠IL-1β陽性神經(jīng)元數(shù)量明顯升高，尿酸顯著降低IL-1β陽性神經(jīng)元數(shù)目(P<0.05)(圖5D)。這些結(jié)果表明，尿酸能有效抑制MPTP誘導的神經(jīng)炎癥反應。

為了探討尿酸對PD小鼠系統(tǒng)性炎癥反應的影響，我們測定了尿酸處理MPTP小鼠海馬和血清中炎性細胞因子的水平。MPTP誘導海馬和血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著升高，但被尿酸處理所顯著抑制(P<0.05)(圖5E、F、G)。這表明，尿酸可能抑制PD小鼠產(chǎn)生產(chǎn)促炎癥細胞因子，并可能與減輕腦損傷有關(guān)。

3 討論

本研究表明，尿酸能顯著減輕MPTP誘導的PD小鼠的行為和認知功能障礙，降低黑質(zhì)區(qū)TH陽性神經(jīng)元數(shù)目和紋狀體多巴胺含量。尿酸激活Nrf2-ARE通路，增強PD小鼠黑質(zhì)Nrf2 mRNA和下游靶基因γ-GCLC、HO-1和NQO1的轉(zhuǎn)錄。尿酸對氧化應激有抑制作用，增加中腦SOD、CAT和GSH含量，降低MDA含量。尿酸降低海馬區(qū)IL-1β陽性神經(jīng)元數(shù)，降低海馬和血清IL-1β、IL-6和TNF-α水平。這些數(shù)據(jù)提供了明確的證據(jù)表明尿酸對PD小鼠多巴胺能神經(jīng)元具有有效的神經(jīng)保護作用。此外，這種保護作用可能與Nrf2-ARE通路激活，抑制氧化應激及炎癥反應有關(guān)。

注：與對照組相比aP<0.05；與MPTP組相比，bP<0.05圖1 尿酸改善PD小鼠運動和認知功能：尿酸明顯延長跌落潛伏期(A)，縮短爬下時間(B)。Morris水迷宮測試顯示與MPTP組相比，尿酸處理顯著降低逃避潛伏期(C)，增加穿越平臺數(shù)(D)

注：與對照組相比，aP<0.05；與MPTP組相比，bP<0.05圖3 尿酸激活Nrf2-ARE信號通路。尿酸顯著增加MPTP小鼠Nrf2 mRNA的表達水平(d7,d14)(A)，以及增加Nrf2應答基因γ-GCLC(B)，HO-1(C)和NQO1(D)的mRNA表達水平

注：與對照組相比，aP<0.05；與MPTP組相比，bP<0.05圖4 尿酸抑制MPTP小鼠氧化應激：與對照組相比，MPTP小鼠的中腦SOD(A)、CAT(B)和谷胱甘肽(C)水平降低，MDA含量升高。尿酸處理可顯著提高MPTP小鼠SOD、CAT和GSH含量，降低MDA含量

尿酸是核酸降解產(chǎn)物，與健康對照組相比，PD病人血清和黑質(zhì)中尿酸含量明顯降低[6-7]。低尿酸血癥與PD病人的認知功能障礙有關(guān)[8]。因此，提高血清尿酸水平可能對PD動物和病人有神經(jīng)保護作用。我們以往的研究表明，尿酸鹽抑制6-OHDA誘導的PC12細胞氧化損傷[9]。本研究則提供了尿酸對PD神經(jīng)保護的體內(nèi)證據(jù)。尿酸不僅改善行為和認知障礙，還能保護多巴胺能神經(jīng)元，表現(xiàn)為黑質(zhì)TH陽性神經(jīng)元數(shù)增多和紋狀體多巴胺含量增加。本研究中尿酸處理采用腹腔注射(250 mg/kg)的方法。而我們以前的研究表明，腹腔注射尿酸鹽能提高PD大鼠血漿(55%)和紋狀體(36.8%)尿酸鹽含量[10]。這表明尿酸可以穿過血腦屏障，是PD的一種很有前途的治療策略。

本研究表明，尿酸能在MPTP小鼠黑質(zhì)激活Nrf2信號通路。Nrf2是一種轉(zhuǎn)錄因子，氧化應激時能結(jié)合抗氧化反應元件(ARE)并啟動幾百種氧化應激相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄。Nrf2-ARE抗氧化通路異常參與了PD的發(fā)病[11]。我們的結(jié)果顯示尿酸增強轉(zhuǎn)錄的Nrf2靶基因包括γ-GCLC、HO-1和NQO-1，這些基因都具有抗氧化功能。我們以前的研究在體外培養(yǎng)的細胞系證明了尿酸的抗氧化功能：體外尿酸鹽預處理能在6-OHDA誘導的多巴胺能細胞激活Nrf2-ARE信號通路[12]。綜上所述，尿酸抑制MPTP小鼠氧化應激反應，可能是通過激活Nrf2-ARE抗氧化通路實現(xiàn)的。

本研究還表明，尿酸能有效抑制MPTP小鼠的神經(jīng)炎癥反應，如海馬區(qū)IL-1β陽性神經(jīng)元數(shù)量顯著減少。海馬位于顳葉，與學習記憶功能相關(guān)。MPTP誘導的PD小鼠顯示海馬細胞凋亡和短時記憶減弱[13]，這與PD病人的認知功能降低是一致的[14]。此外，海馬區(qū)高表達IL-1β能損害小鼠的空間記憶能力[15]，這證實了本實驗中尿酸降低PD小鼠海馬區(qū)IL-1β表達，同時改善了空間記憶能力。神經(jīng)炎癥反應不僅參與了PD的發(fā)病機制，還能促進各種炎性細胞因子釋放入循環(huán)，如IL-1β，IL-6和TNF-α[16]，這是與我們的結(jié)果一致。因此，尿酸可能通過血腦屏障直接靶向腦組織，尤其是黑質(zhì)和海馬，從而對PD小鼠發(fā)揮抗炎作用。

總之，本研究證實尿酸對帕金森小鼠多巴胺能神經(jīng)元具有顯著的神經(jīng)保護作用。尿酸對運動和認知功能的改善，可能與激活Nrf2-ARE通路，抑制氧化損傷和炎癥反應有關(guān)。尿酸可能是PD的一種很有前途的治療劑。

(本文圖2,5見插圖7-2)