韓東岳 趙海軍 綦海燕

[摘要]目的 探討Arpin蛋白在前列腺癌中的表達(dá)及臨床意義。方法 收集2013年1月～2014年9月青島市市立醫(yī)院136例前列腺癌患者及120例前列腺增生患者的臨床資料。應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)Arpin蛋白在前列腺癌及前列腺增生組織中的表達(dá)水平。回顧性分析Arpin蛋白與前列腺癌患者臨床病理特征和生存率的關(guān)系。結(jié)果 與前列腺增生組織比較，前列腺癌組織中的Arpin蛋白表達(dá)降低（28.68% vs. 70.00%，χ2=43.611，P<0.001）。Arpin蛋白表達(dá)水平與TNM分期、Gleason評(píng)分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（P<0.05）。多變量Cox回歸分析顯示，Arpin蛋白表達(dá)（HR：0.341；95%CI：0.193～0.601；P<0.001）是前列腺癌患者無病生存期的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。結(jié)論 Arpin蛋白在前列腺癌組織中呈低表達(dá)，且與前列腺癌的臨床病理特征存在相關(guān)性，影響前列腺癌的不良預(yù)后。

[關(guān)鍵詞]Arpin蛋白；前列腺癌；臨床病理特征；預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R737.25 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2019）5（b）-0021-04

[Abstract] Objective To investigate the expression and clinical significance of Arpin protein in prostate cancer. Methods Altogether the data of 136 patients with prostate cancer and 120 patients with benign prostatic hyperplasia were collected from January 2013 to September 2014 in Qingdao Municipal Hospital. Immunohistochemical technique was used to detect the expression of Arpin protein in prostate cancer and prostatic hyperplasia. The relationship between Arpin protein and clinicopathological features and survival rate of patients with prostate cancer was analyzed retrospectively. Results Compared with benign prostatic hyperplasia， the expression of Arpin protein in prostate cancer decreased （28.68% vs. 70.00%， χ2=43.611， P<0.001）. The expression of Arpin protein was closely related to TNM stage， Gleason score and lymph node metastasis （P<0.05）. Multivariate Cox regression analysis showed that Arpin protein expression （HR： 0.341； 95% CI： 0.193-0.601； P<0.001） was an independent prognostic indicator of disease-free survival in prostate cancer patients. Conclusion The expression of Arpin protein in prostate cancer tissue was low， and correlated with the clinicopathological characteristics of prostate cancer， which affects the adverse prognosis of prostate cancer.

[Key words] Arpin protein； Prostate cancer； Clinicopathological characteristics； Prognosis

前列腺癌（prostate cancer，PCa）的發(fā)病率在全世界男性惡性腫瘤中位居第二位。據(jù)統(tǒng)計(jì)，僅在2017年美國(guó)就有26 730人死于PCa，這是導(dǎo)致癌癥死亡的第二大原因[1]。PCa轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因。轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了大約90%的癌癥相關(guān)患者死亡。絕大多數(shù)患者早期并無典型癥狀，一經(jīng)確診，多數(shù)已發(fā)展成晚期[2]。Arp2/3復(fù)合體參與了一些癌癥的發(fā)展和遷移，通過一系列的相互作用，對(duì)PCa細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移性具有促進(jìn)作用[3]。

據(jù)報(bào)道，Arpin蛋白是Arp2/3復(fù)合物的一種新的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。Arpin蛋白是由C15ORF38基因編碼的蛋白質(zhì)，包含220個(gè)氨基酸殘基和一個(gè)羧基結(jié)構(gòu)區(qū)域，但沒有C端末端、螺旋或單個(gè)肌動(dòng)蛋白結(jié)合區(qū)域[4]。然而，Arpin蛋白包含Arp2/3復(fù)合物的假定結(jié)合位點(diǎn)，該位點(diǎn)與癌細(xì)胞的發(fā)育和遷移密切相關(guān)，Arpin可與Arp2/3結(jié)合的成核因子競(jìng)爭(zhēng)，抑制Arp2/3復(fù)合物的活化，從而抑制了肌動(dòng)蛋白絲的聚合[5]。相關(guān)研究表明，Arpin蛋白與乳腺癌、胃癌的臨床特征和預(yù)后有關(guān)[6-7]。然而，在人PCa中Arpin蛋白的表達(dá)是否發(fā)生變化，以及該表達(dá)與患者的臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，目前尚不清楚。在本研究中，初步確認(rèn)了Arpin蛋白表達(dá)與PCa的關(guān)系，進(jìn)一步研究了Arpin蛋白的異常表達(dá)與PCa患者臨床意義和預(yù)后之間的相關(guān)性。

1資料與方法

1.1一般資料

收集2013年1月～2014年9月在青島市市立醫(yī)院行PCa根治手術(shù)的136例患者的臨床資料，另收集120例行前列腺電切手術(shù)的前列腺增生患者的臨床資料。收集的所有病理均經(jīng)組織學(xué)證實(shí)。研究對(duì)象的納入標(biāo)準(zhǔn)：①PCa患者術(shù)前均未接受放化學(xué)治療，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及其他器官腫瘤。②前列腺增生患者術(shù)前均未行相關(guān)藥物治療，無其他器官腫瘤病史。

1.2免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色

對(duì)4 μm厚的10%甲醛固定及石蠟包埋的組織進(jìn)行染色。將標(biāo)本煮沸 3 min，然后在標(biāo)本中加入3%的過氧化氫溶液，置于室溫孵育 10 min，用緩沖液沖洗樣品，并與Arpin （sc-242049）特異性的山羊多克隆抗體孵育。最終稀釋到 1∶25，放入 4℃冰箱中孵育 24 h。之后再由緩沖液清洗3次。用生物素標(biāo)記抗山羊免疫球蛋白作為第二抗體。最后，用3、3 -二氨基苯胺四氫氯化物和過氧化氫對(duì)切片進(jìn)行水洗和染色，用蘇木精進(jìn)行復(fù)染后得到褐色色素。

1.3 IHC分析和評(píng)分

在光學(xué)顯微鏡下，Arpin蛋白陽性表達(dá)表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)被染成深褐色。根據(jù)Arpin蛋白陽性的癌細(xì)胞染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞所占比例判斷IHC染色結(jié)果。根據(jù)染色強(qiáng)度，無染色的細(xì)胞為0分、弱染色記為1分、中等染色記為2分、強(qiáng)染色計(jì)為3分。染色腫瘤細(xì)胞比例0%的為0分，0%～25%計(jì)為1分，>25%～50%計(jì)為2分，>50%計(jì)為3分。上述兩種評(píng)分的分?jǐn)?shù)總和為最終得分，最終得分<3分為低表達(dá)，>3分為高表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用χ2檢驗(yàn)分析Arpin蛋白與臨床病例參數(shù)之間的關(guān)系。通過Pearson相關(guān)分析確定協(xié)變量之間的相關(guān)性。用Kaplan-Meier方法繪制無病生存期（disease-free survival，DFS）的生存曲線，利用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行生存曲線的比較。建立了Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，評(píng)價(jià)生存變量的顯著性，進(jìn)一步評(píng)估Arpin蛋白對(duì)DFS的獨(dú)立影響，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Arpin蛋白在PCa和前列腺增生組織中表達(dá)的比較

136例PCa組織中，39例（28.68%）Arpin蛋白呈高表達(dá)，97例（71.32%）Arpin蛋白呈低表達(dá)；120例前列腺增生組織中，84例（70.00%）Arpin蛋白呈高表達(dá)，36例（30.00%）Arpin蛋白呈低表達(dá)。Arpin蛋白在PCa組織中的高表達(dá)率明顯低于前列腺增生組織（28.68% vs. 70.00%，χ2=43.611，P<0.001）（圖1）。

2.2 Arpin蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

Arpin蛋白表達(dá)與患者年齡、腫瘤大小無關(guān)（P>0.05），而與Gleason分級(jí)、TNM分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05）（表1）。

2.3 PCa患者Arpin蛋白表達(dá)與DFS的相關(guān)性

為了驗(yàn)證Arpin蛋白表達(dá)的臨床效用，通過Kaplan-Meier分析，評(píng)價(jià)了Arpin蛋白表達(dá)和臨床病理特征對(duì)DFS的影響。結(jié)果表明，與Arpin蛋白高表達(dá)的患者比較，Arpin蛋白低表達(dá)的患者預(yù)后較差（圖2，P<0.05）。進(jìn)一步采用單變量Cox回歸分析結(jié)果顯示，Arpin蛋白表達(dá)（P<0.001），TNM分期（P<0.001）、Gleason分級(jí)（P<0.001）、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移（P=0.017）顯著影響患者的DFS。多變量Cox回歸分析表明，Arpin蛋白表達(dá)（P<0.001）、TNM分期（P<0.05）、Gleason分級(jí)（P<0.05）是PCa患者DFS的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)（表2）。

3討論

近年來，PCa發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢(shì)，通常伴有局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這是導(dǎo)致癌癥死亡的主要原因[8]。PCa容易發(fā)展成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，尤其是骨轉(zhuǎn)移最為常見，骨轉(zhuǎn)移率高達(dá)90%[9]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，PCa患者5年生存率<30%，其中侵襲、轉(zhuǎn)移是PCa遠(yuǎn)期預(yù)后主要的影響因素[10]。腫瘤的轉(zhuǎn)移能力是由分子變化所決定的。轉(zhuǎn)移性質(zhì)的特征可以通過蛋白質(zhì)編碼改變和影響基因調(diào)控的非編碼變異來獲得。隨著分子生物學(xué)研究的進(jìn)展，越來越多的研究表明，PCa患者的臨床結(jié)果因基因改變而廣受影響，PCa基因改變逐漸被認(rèn)為是腫瘤起始、發(fā)展、局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移的決定因素[11]。所以，在實(shí)驗(yàn)研究中獲得相關(guān)的預(yù)后生物標(biāo)志和新的治療靶點(diǎn)具有至關(guān)重要的作用。因此，闡明這些因素和其表達(dá)模型有助于更好地了解PCa的進(jìn)展，為PCa提供新的治療策略，并預(yù)測(cè)臨床結(jié)果。

細(xì)胞遷移是組織修復(fù)、再生、免疫反應(yīng)等的重要生理過程，異常的遷移會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移。細(xì)胞遷移是一個(gè)多步驟的過程，主要由外部刺激引起，導(dǎo)致細(xì)胞骨架變化和膜突的形成[12]。在推動(dòng)癌細(xì)胞遷移過程中，板狀偽足起著重要的作用，是腫瘤細(xì)胞探索其外環(huán)境的主要工具，并與細(xì)胞外基質(zhì)形成新的黏附，以促進(jìn)運(yùn)動(dòng)和傳播[13-14]。板狀偽足通過改變肌動(dòng)蛋白的細(xì)胞骨架，驅(qū)動(dòng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。Arp2/3復(fù)合體是肌動(dòng)蛋白的主要控制器，肌動(dòng)蛋白聚合是由Arp2/3復(fù)合體調(diào)控的，它被認(rèn)為是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器，它介導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白多聚化作用是板狀偽足形成的關(guān)鍵，通過調(diào)控板狀偽足來控制細(xì)胞遷移[15]。

肌動(dòng)蛋白聚合是一種依賴于細(xì)胞骨架動(dòng)態(tài)重組的多細(xì)胞過程的機(jī)制，這一過程依賴于Arp2/3復(fù)合體[16]。Arp2/3復(fù)合體能刺激肌動(dòng)蛋白聚合，推動(dòng)細(xì)胞遷移，參與多種癌癥的發(fā)展和遷移[3]。Dang等[4]發(fā)現(xiàn)了一種新的蛋白質(zhì)——Arpin蛋白，其作為Arp2/3復(fù)合體的負(fù)調(diào)節(jié)器，能夠抑制其活化，從而達(dá)到抑制細(xì)胞遷移的作用。然而，在PCa組織中，Arpin蛋白表達(dá)仍然是未知的。

本研究通過IHC比較了PCa組織和前列腺增生組織中的Arpin蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，在PCa組織樣本中，Arpin蛋白表達(dá)明顯低于前列腺增生組織（P<0.05）。因此，PCa中Arpin蛋白水平降低可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤獲得侵襲性和轉(zhuǎn)移性能力。然后，研究了Arpin蛋白表達(dá)與腫瘤TNM分期、Gleason分級(jí)的相關(guān)性。IHC結(jié)果顯示，Arpin蛋白低表達(dá)與晚期TNM分期具有顯著相關(guān)性（P<0.05）。腫瘤分期越晚Arpin蛋白表達(dá)水平越低，表明惡性程度越高。Arpin蛋白表達(dá)與PCa病理Gleason分級(jí)也有明顯的相關(guān)性。眾所周知，PCa的Gleason分級(jí)在PCa的診治中也扮演著重要角色。美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）建議PCa患者Gleason評(píng)分>7分應(yīng)該進(jìn)行ECT檢測(cè)，以減少骨轉(zhuǎn)移漏診的可能性[17]?？梢?，PCa轉(zhuǎn)移與Gleason評(píng)分具有一定的相關(guān)性。本研究中，Pca Gleason高分級(jí)的組織中，Arpin蛋白表達(dá)也相對(duì)較低。區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者PCa組織中的Arpin蛋白表達(dá)低于未發(fā)生轉(zhuǎn)移的組織。

更重要的是，為了探討Arpin蛋白對(duì)PCa患者預(yù)后的影響，本研究對(duì)Arpin蛋白低表達(dá)組和高表達(dá)組3年DFS進(jìn)行比較分析，研究發(fā)現(xiàn)，Arpin蛋白低表達(dá)患者明顯比高表達(dá)的患者預(yù)后差。有臨床研究認(rèn)為，PCa的預(yù)后情況與腫瘤的TNM分期、Gleason評(píng)分及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性，并認(rèn)為，在新診斷的PCa患者中，TNM分期、Gleason評(píng)分是預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。本研究提示，Arpin蛋白、TNM分期、Gleason評(píng)分是Pca DFS的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。

本研究存在一定的局限性，研究病例數(shù)較少，該發(fā)現(xiàn)應(yīng)該通過大量的樣本研究進(jìn)一步證實(shí)。近年來，針對(duì)癌癥進(jìn)展過程中關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因子的靶向治療已經(jīng)取得發(fā)展[18]。這種機(jī)制可能幫助開發(fā)新的治療靶點(diǎn)。

綜上所述，Arpin蛋白在PCa組織中呈低表達(dá)，提示PCa容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。Arpin表達(dá)與PCa患者的臨床特征和預(yù)后有關(guān)。

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（收稿日期：2018-11-12 本文編輯：許俊琴）