余森泉 董存柱 蘇綠 郭教虹 侯宗敏

摘? 要? 尋找和開發(fā)安全有效的植物性殺蟲劑，以豐富植物源農(nóng)藥的來源，填補(bǔ)化學(xué)農(nóng)藥禁限用留下的空白。甲醇冷浸提取法制備遼細(xì)辛、石楠藤、金獅藤等16種中草藥的提取物，采用無限量取食法，測定了對家蠅成蟲的活性，采用幼蟲浸液法，測定了對埃及伊蚊四齡幼蟲的活性。結(jié)果表明：在10 mg/mL濃度下，處理家蠅48 h后，遼細(xì)辛、石楠藤、金獅藤、單葉細(xì)辛校正死亡率分別為100%、100%、100%和98.33%，LC50值分別為0.1483、0.1544、3.5277和2.4292 mg/mL，三葉魚藤LC50值為0.9080 mg/mL;在0.5 mg/mL濃度下處理埃及伊蚊四齡幼蟲48 h，遼細(xì)辛、石楠藤、金獅藤、單葉細(xì)辛、厚樸校正死亡率分別為100%、100%、100%、100%和100%，LC50值分別為0.0046、0.0094、0.0570、0.0658和0.0504 mg/mL，三葉魚藤為0.1194 mg/mL。遼細(xì)辛、石楠藤、單葉細(xì)辛、金獅藤對兩種試蟲均表現(xiàn)出優(yōu)良的殺蟲活性，均優(yōu)于或接近三葉魚藤活性。

關(guān)鍵詞? 馬兜鈴酸;馬兜鈴內(nèi)酰胺;殺蟲活性;家蠅;埃及伊蚊

中圖分類號? S482.3? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

Abstract? In order to find and develop safe and effective botanical insecticides， to enrich the sources of botanical pesticides and fill the gaps left by prohibitions and restrictions on the use of chemical pesticides， sixteen kinds of Chinese herbal medicines were extracted by methanol， and the insecticidal activity against adult Musca domestica was tested by the method of unlimited intake， and that against the fourth instar larvae of Aedes aegypti was tested by the larval immersion method. The results showed that after 48 h treatment at 10 mg/mL， the corrected mortality rates of Asarum heterotropoides F. Schmidt var. mandshuricum （Maxim.） Kitag， Piper wallichii （Miq.） Hand-Mazz， Aristolochia kaempferi Willd. [A.mollis Dunn]， Asarum himalaicum Hook. f. et Thoms. ex Klotzsch was 100%， 100%， 100% and 98.33%， respectively， and the LC50 value separately was 0.1483， 0.1544， 3.5277 and 2.4292 mg/mL， while that for Derris trifoliata Lour was 0.9080 mg/mL. Against the 4th instar larvae of A. aegypti at 0.5 mg/mL for 48 h， the corrected mortality rate of A. heterotropoides， P. wallichii， A. kaempferi， A. himalaicum， and Magnolia officinalis Rehd. et Wils. was 100%， 100%， 100%， 100% and 100%， separately， and the LC50 value was 0.0046， 0.0094， 0.0570， 0.0658 and 0.0504 mg/mL， respectively， while that for D. trifoliata Lour was 0.1194 mg/mL. A. heterotropoides， P. wallichii， A. kaempferi， A. himalaicum showed excellent insecticidal activity on the two tested insects， better than or close to the activity of the control D. trifoliata.

Keywords? aristolochic acid; aristololactam; insecticidal activity; Musca domestica; Aedes aegypti

DOI? 10.3969/j.issn.1000-2561.2019.05.024

近年來，世界各國在不斷地加強(qiáng)對高毒高殘留農(nóng)藥的管理力度，農(nóng)藥壁壘在國際農(nóng)產(chǎn)品市場即將全面形成，不僅嚴(yán)重沖擊發(fā)展中國家的農(nóng)藥生產(chǎn)和出口，而且把使用了高毒高殘留農(nóng)藥的農(nóng)產(chǎn)品拒之于世界主要市場之外，因此，在作物上使用更加安全的生物農(nóng)藥來代替化學(xué)農(nóng)藥已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。植物源農(nóng)藥是生物農(nóng)藥的重要組成部分，具有低殘留、對環(huán)境無污染，選擇性高、對非靶標(biāo)生物相對安全，開發(fā)成本低廉、易和其他農(nóng)藥混配等優(yōu)點(diǎn)，成為近幾年開發(fā)利用的一個熱點(diǎn)。

馬兜鈴內(nèi)酰胺衍生物類化合物包括馬兜鈴內(nèi)酰胺或馬兜鈴酸及其硝基菲類有機(jī)酸衍生物成分，主要存在于馬兜鈴酸科馬兜鈴酸屬（Arisrolochia）、細(xì)辛屬（Asarum）、木通科木通屬（Akebia）、毛莨科鐵線蓮屬（Clematis）、防己科千金藤屬（Stephania）、蝙蝠葛屬（Menispernum）、菊科川木通屬（Vladimiria）等幾十種植物中[1]，分布在熱帶和亞熱帶地區(qū)，溫帶地區(qū)有少數(shù)分布[2]。馬兜鈴酸、馬兜鈴內(nèi)酰胺藥理作用廣泛，有抗感染、鎮(zhèn)痛、疏通心血管的藥理作用、抗癌、增強(qiáng)細(xì)胞免疫、終止妊娠及減肥等功能[3-4]。長期以來，含有馬兜鈴酸的中藥材被廣泛應(yīng)用于消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等多種疾病的治療[5]。但是，1993年比利時學(xué)者Vanherweghen等[6]報道了服用含廣防己的減肥藥出現(xiàn)急性腎間質(zhì)纖維化、慢性進(jìn)行性腎功能不全的病例。近些年，隨著大量的臨床報道和實(shí)驗(yàn)研究，馬兜鈴酸的腎毒性和其他毒性作用陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，美國食品藥品管理局也在2000年5月相繼發(fā)布了2個有關(guān)含有馬兜鈴酸植物藥物和食品的通告，對進(jìn)口的相關(guān)草藥和制劑進(jìn)行限制[5]。2017年10月18日，來自新加坡和中國臺灣的研究人員在Science子刊Science Translational Medicine發(fā)布了關(guān)于在中國臺灣和整個亞洲地區(qū)馬兜鈴酸及其衍生物的使用和肝癌發(fā)生密切相關(guān)的研究論文[7-8]。因此很多西方國家已全面禁止含有馬兜鈴酸（AAs）的中藥出售。中國國家食品藥品監(jiān)督管理局也取消了相關(guān)藥物如關(guān)木通、廣防己、青木香等中藥的藥用標(biāo)準(zhǔn)[9]。很多相關(guān)中草藥已經(jīng)禁止或限制在中藥中使用，作者考慮到很多這類中藥都有一定毒性，為了擴(kuò)大這些中藥的用途，探討其在農(nóng)藥方面開發(fā)利用，對含有馬兜鈴內(nèi)酰胺和馬兜鈴酸的中藥進(jìn)行殺蟲活性篩選，以期找到新的植物源殺蟲植物，最終找到新的農(nóng)藥前體化合物。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 植物樣品? 中藥材樣品均購買自安徽毫州皖北趙氏藥業(yè)，經(jīng)中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所王清隆鑒定17種中藥材樣品（表1），其中一種為經(jīng)典對照殺蟲植物三葉魚藤，標(biāo)本儲存于海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院天然源農(nóng)藥研究實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2? 供試?yán)ハx? 家蠅（Musca domestica Linaeus）由天然源農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng);埃及伊蚊（Aedes aegypti）供試蟲種為本實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的敏感品系，由海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院動系韓謙教授實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3? 主要儀器與試劑? EYELA（N-1100）旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，日本東京理化器械株式會社;20 L Laborata 4001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司;FED400烘箱，德國Binder公司;ME104型電子天平，瑞士Mettler Toledo公司。所用試劑工業(yè)甲醇、二甲基亞砜等均為分析純，為廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.2? 方法

1.2.1? 浸膏的提取? 采用冷浸提法，將采購的中藥材分別置于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中，控溫（50±2）℃烘干，經(jīng)粉碎機(jī)粉碎，甲醇浸泡提取，反復(fù)3次，濾液在60 ℃減壓蒸餾濃縮，即得到甲醇初提取浸膏，合并3次浸提膏，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2? 試蟲飼養(yǎng)? 家蠅和埃及伊蚊的飼養(yǎng)方法參考董存柱等[10]研究中的方法。

1.2.3? 對家蠅活性篩選? 經(jīng)過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定10 mg/mL為家蠅活性篩選濃度。稱取3.00 g蔗糖置于透明一次性杯子中（口直徑6.00 cm，底直徑4.00 cm，高8.50 cm）備用，每種稱取提物浸膏0.15 g放入25 mL燒杯中，加入10 mL丙酮使其充分溶解，定容至15 mL，最終濃度為10 mg/mL。移液槍移取3 mL配制好的藥液于杯中，每個濃度設(shè)3個重復(fù)，空白對照組用丙酮處理后置于風(fēng)扇下吹12 h，使丙酮揮發(fā)完全。三角瓶抓取家蠅，紗布蒙口，將乙醚濕潤的棉花置于瓶口，麻醉后迅速計(jì)數(shù)20只家蠅放入杯中，紗布封口，紗布外放一潤濕棉花球供水。觀察記錄6、48 h家蠅的死亡數(shù)，統(tǒng)計(jì)死亡率。

1.2.4? 對埃及伊蚊活性篩選? 經(jīng)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)確定0.5 mg/mL為活性篩選濃度。提取物藥液的配制：分別稱取0.1 g浸膏置于燒杯，加2 mL二甲基亞砜助溶，攪拌溶解后加脫氯水定容至200 mL備用;等量溶劑加入脫氯水作為對照。

殺蟲活性的測定：向一次性杯子（參數(shù)同1.2.3）中移入20 mL配好的藥液，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)滴管吸取20只飼養(yǎng)5 d的大小均一、發(fā)育一致的埃及伊蚊幼蟲。死亡標(biāo)準(zhǔn)：蟲體僵直、尾部明顯變黑，浮于藥液上或沉于底部。于6、48 h統(tǒng)計(jì)結(jié)果，記錄死亡數(shù)并計(jì)算埃及伊蚊幼蟲校正死亡率。

1.2.5? 高活性提取物對家蠅的LC50? 取初篩活性明顯的4種中草藥（遼細(xì)辛、石楠藤、單葉細(xì)辛、金獅藤）和對照三葉魚藤根甲醇提取物進(jìn)行毒力測定。溶液濃度配制：遼細(xì)辛、石楠藤各取0.018 g，單葉細(xì)辛、金獅藤各0.36 g，每種藥分別放入50 mL燒杯中，對應(yīng)加入45 mL丙酮，得到母溶液，據(jù)公式C1×V1= C2×V2梯度配制其余濃度，最終配制得到遼細(xì)辛和石楠藤濃度分別為0.40、0.35、0.30、0.25、0.20、0.15 mg/mL，金獅藤和單葉細(xì)辛為8、7、6、5、4、3、2 mg/mL。三葉魚藤根甲醇提取物梯度稀釋至濃度為10、5、2.5、1.25、0.625 mg/mL，測定方法同1.2.3，48 h后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

家蠅死亡標(biāo)準(zhǔn)：家蠅被擊倒，蟲體出現(xiàn)失水現(xiàn)象，觸角不動，或六足、口器、翅微顫[11]。

1.2.6? 高活性提取物對埃及伊蚊的LC50? 根據(jù)篩選結(jié)果確定5種提取物進(jìn)行毒力測定，金獅藤：稱取0.2 g金獅藤浸膏提取物，加2 mL二甲基亞砜助溶，以脫氯水定容至200 mL為母液，其母液質(zhì)量濃度為1 mg/mL，取母液18 mL加82 mL脫氯水定容100 mL，得到0.18 mg/mL的質(zhì)量濃度，最終配制成質(zhì)量濃度分別為0.18、0.15、0.12、0.09、0.06 mg/mL的藥液;單葉細(xì)辛和厚樸的配制同金獅藤，最終得到0.15、0.12、0.09、0.06、0.03 mg/mL 5個質(zhì)量濃度;遼細(xì)辛：取0.05 g浸膏提取物，加2 mL二甲基亞砜溶解，加脫氯水定容至1000 mL，方法同金獅藤配制方法，最終得到0.017、0.014、0.011、0.008、0.005 mg/mL 5個質(zhì)量濃度;石楠藤的配制同遼細(xì)辛，最終得到質(zhì)量濃度分別為0.02、0.017、0.014、0.011、0.008 mg/mL，三葉魚藤根浸膏最終配制濃度為1、0.5、0.25、0.125、0.0625 mg/mL，等量二甲基亞砜加入脫氯水作為對照。

處理方法同1.2.4，于處理后6、48 h觀察、記錄死亡蟲數(shù)、測定LC50。

1.3? 數(shù)據(jù)處理

死亡率和校正死亡率計(jì)算方法如下：

采用DPS v9.50軟件統(tǒng)計(jì)分析不同處理間的差異顯著性（Duncans新復(fù)極差測定法），毒力測定分析采用毒力回歸方法[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1? 中藥甲醇提取物對家蠅和埃及伊蚊活性篩選

從表2可以看出含馬兜鈴酸和馬兜鈴內(nèi)酰胺類中藥甲醇提取物，在處理6 h后遼細(xì)辛、石楠藤、金獅藤、單葉細(xì)辛對家蠅和埃及伊蚊均表現(xiàn)良好殺蟲活性及速效性，家蠅校正死亡率分別為100%、100%、71.67%、63.33%，埃及伊蚊為100%、100%、96.67%、100%，厚樸、關(guān)木通和鼻血雷僅表現(xiàn)對埃及伊蚊良好殺蟲活性及速效性，校正死亡率分別為96.67%、48.33%、70.00%。

在處理48 h后，遼細(xì)辛、石楠藤、金獅藤、單葉細(xì)辛對家蠅活性4者之間差異不顯著，均表現(xiàn)優(yōu)良?xì)缁钚?，校正死亡率分別為100%、100%、100%、98.33%，青木香、厚樸、鼻血雷表現(xiàn)一定殺家蠅活性，校正死亡率分別為36.67%、23.33%、31.67%;遼細(xì)辛、石楠藤、金獅藤、單葉細(xì)辛、厚樸、關(guān)木通、鼻血雷、背蛇生均表現(xiàn)優(yōu)良的對埃及伊蚊的殺滅活性，校正死亡率分別為100%、100%、100%、100%、100%、86.67%、96.67%、95.00%，馬兜鈴和青木香表現(xiàn)一定殺埃及伊蚊活性，校正死亡率分別為31.67%、23.33%。遼細(xì)辛、石楠藤、金獅藤、單葉細(xì)辛對2種試蟲均表現(xiàn)出優(yōu)良?xì)⑾x活性。

2.2? 高活性中藥甲醇提取物對家蠅和埃及伊蚊的LC50

由表3可以看出遼細(xì)辛、石楠藤甲醇提取物在處理48 h后對家蠅有優(yōu)良的殺蟲活性，LC50分別為0.1483、0.1544 mg/mL，優(yōu)于對照三葉魚藤提取物的0.9080 mg/mL，單葉細(xì)辛、金獅藤、殺家蠅活性接近對照三葉魚藤LC50分別為2.4292、3.5277 mg/mL，也表現(xiàn)較好殺蟲活性。

遼細(xì)辛、石楠藤、單葉細(xì)辛、金獅藤、厚樸甲醇提取物對埃及伊蚊均表現(xiàn)優(yōu)良?xì)⑾x活性LC50分別為0.0046、0.0094、0.0658、0.0570、0.0504 mg/mL，優(yōu)于對照三葉魚藤提取物的0.1194 mg/mL。

遼細(xì)辛、石楠藤、單葉細(xì)辛、金獅藤對家蠅和埃及伊蚊兩種試蟲都表現(xiàn)出較好殺蟲活性。

3? 討論

在篩選的16種中藥中，遼細(xì)辛、石楠藤、單葉細(xì)辛、金獅藤、厚樸有良好殺蟲活性，莫建初等[12]曾報道細(xì)辛對黃胸散白蟻的毒效，證明華細(xì)辛（Ascrum sieboldii）粉對黃胸散白蟻（Reticulitermes speratus）具有較強(qiáng)的毒殺效果和驅(qū)避活性，韓俊艷[13]報道了北細(xì)辛揮發(fā)油對二斑葉螨（Tetranychus urticae Koch）的熏蒸毒性和北細(xì)辛甲醇提取物對二斑葉螨雌成螨和卵的觸殺活性，楊銀書等[14]研究了細(xì)辛揮發(fā)油對草原革蜱（Dermacentor nuttallii）、日本血蜱（Haemaphysalis japonica）、青海血蜱（H. qinghaiesis）成蟲、血紅扇頭蜱（Rhipicephalus sanguineous）成蟲等具有較好的麻痹及驅(qū)避作用，王桂清等[15]測定了細(xì)辛精油對淡色庫蚊（Culex pipiens pallens Coq.）幼蟲的毒殺作用和對成蟲的熏蒸、觸殺作用，結(jié)果表明，細(xì)辛精油對淡色庫蚊幼蟲有較強(qiáng)的毒殺作用，楊秀娟等[16]報道華細(xì)辛葉的水提取液對南方根結(jié)線蟲（Mefoldogyne incognila）二齡幼蟲的殺蟲效果（24 h）為100%，張啟東[17]最早報道了厚樸對桃蚜和山楂葉螨的殺蟲活性，華細(xì)辛和北細(xì)辛有較多殺蟲活性方面的報道，其他篩選含類似成分中藥除厚樸外沒有殺蟲活性相關(guān)報道。

關(guān)于馬兜鈴酸的活性報道集中在人的腎毒毒性報道[5]，這類化合物和含這類化合物中藥中分離出化合物的殺蟲活性報道還比較少，如本課題組馬浩偉等從北馬兜鈴中分離到馬兜鈴內(nèi)酰胺W、馬兜鈴內(nèi)酰胺X、馬兜鈴內(nèi)酰胺Y、N-羥基馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ、馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ、9-甲氧基馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ六個化合物，其中N-羥基馬兜鈴內(nèi)酰胺Ⅰ表現(xiàn)出較強(qiáng)的對埃及伊蚊四齡幼蟲的殺蟲活性，其LC50值為3.54 μg/mL[18]，作者測試遼細(xì)辛和石楠藤的甲醇提取物的殺埃及伊蚊活性的LC50分別為0.0046、0.0094 mg/mL，與北馬兜鈴高活性化合物活性相當(dāng);Venkatraman等[19]從Aristolochia indica Linn.分離得到馬兜鈴酸Ⅰ和馬兜鈴酸Ⅱ，對malaria mosquito 四齡幼蟲有較強(qiáng)的殺蟲活性，其LC50值分別為0.5023和0.5432 mg/mL，而遼細(xì)辛、石楠藤、單葉細(xì)辛、金獅藤、厚樸對埃及伊蚊四齡幼蟲活性的LC50分別為0.0046、0.0094、0.0658、0.0570、0.0504 mg/mL，均明顯好于以上馬兜鈴酸的殺蟲活性，雖然試蟲稍有不同，但作者篩選的均為中藥的甲醇粗提取物，其中所含活性成分的含量相對純化合物較低，推測如果是純化合物，其活性會更高;Gisele等[20]從Aristolochia malmeana根部分離出的（–）-kusunokinin對黎豆夜蛾（Anticarsia gemmatalis）殺蟲活性達(dá)到LD10 = 9.3、LD50 = 230.1 ?g/?L;Nascimento等[21]從Aristolochia pubescens分離出的馬兜鈴酸和ent-kaur-15-en-17-ol能顯著延長黎豆夜蛾（A. gemmatalis）的幼蟲期，（+）-eudesmin和（+）-sesamin能夠造成其成蟲畸形，也證明這類中藥具有殺蟲活性。

本文采用家蠅、埃及伊蚊等這些衛(wèi)生害蟲作為試蟲，主要出于方便建立準(zhǔn)確藥效測定評價標(biāo)準(zhǔn)方面的考慮，這些中藥植物的殺蟲譜還應(yīng)對更多的測試對象，特別是農(nóng)業(yè)害蟲進(jìn)行研究。本研究采用胃毒和水浸漬的方法，未使用農(nóng)藥助劑，但對于植物源農(nóng)藥的應(yīng)用，應(yīng)該采用助劑使其更易到達(dá)靶標(biāo)來增加滲透和延展能力，以利充分發(fā)揮藥效。綜上所述，這些中藥材具有較高殺蟲活性，但還沒有相關(guān)文獻(xiàn)開展系統(tǒng)研究，有必要對其化合物進(jìn)行進(jìn)一步的研究。另外防蚊幼蟲產(chǎn)品偏少、品種有限、發(fā)展緩慢，我國與國際上的情況類似，其產(chǎn)品僅占衛(wèi)生用農(nóng)藥總量的1.7%，而這類產(chǎn)品在推動病媒生物綜合防治“三部曲”（即清潔、殺幼、防蚊）中起到重要的先遣防蚊作用[22]。而這類部分中藥優(yōu)良的殺蚊幼蟲特點(diǎn)，可以考慮加工出相關(guān)劑型，如顆粒劑、懸浮劑、可濕性粉劑、緩釋模塊劑等在水中施藥來防治水中幼蟲;其中緩釋模塊劑型直接用于外環(huán)境水體防治蚊幼蟲，是能夠適當(dāng)控制釋放有效成分速度的固體制劑，具有較長的防治有效期和環(huán)保性。所以這類中藥開發(fā)殺蟲活性的應(yīng)用研究和開展活性先導(dǎo)化合物的研究，應(yīng)具有廣闊的前景。

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