劉冉陽 史成銀 謝國駟 李 晨 王海波

(1.中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出 過程功能實驗室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點實驗室 青島市海水養(yǎng)殖流行病學與生物安保重點實驗室 青島 266071；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海 201306)

近年來，隨著石斑魚人工雜交苗種繁育技術(shù)的進步，且雜交子代存在明顯的雜交優(yōu)勢，雜交石斑魚逐漸 成 為 市場的新寵(李 炎璐等,2015; 邵彥翔 等 ,2017)。褐龍斑是褐石斑魚(Epinephelus bruneus♀)與鞍帶石斑魚(E.lanceolatus♂)的雜交子代，存在明顯的雜交優(yōu)勢，是具有較大養(yǎng)殖潛力的石斑魚新品種。由于規(guī)?；B(yǎng)殖時間較短，目前國內(nèi)外尚沒有褐龍斑疾病的報道。2017年 7月，山東省某養(yǎng)殖場褐龍斑出現(xiàn)急性、大量死亡。調(diào)查褐龍斑發(fā)病情況，取瀕死魚的組織進行電鏡切片觀察，在病魚脾、腎等組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量的虹彩病毒樣顆粒。

虹彩病毒是20面體狀的大型DNA病毒，共分為5個病毒屬，其中，腫大細胞病毒屬(Megalocytivirus)的虹彩病毒是魚類的重要病原之一(Jancovichet al,2012)。依據(jù)病毒的主要衣殼蛋白(Major capsid protein,MCP)基因，細胞腫大病毒屬虹彩病毒可分類為 3大類群(基因型)，即主要感染海水魚類的真鯛虹彩病毒(Red sea bream iridovirus,RSIV)類群、主要感染淡水魚類的傳染性脾腎壞死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV)類群和主要感染鲆鰈魚類的大菱鲆紅體病虹彩病毒(Turbot reddish body iridovirus,TRBIV)類群(Fuet al,2011; Kuritaet al,2012)。真鯛虹彩病毒能導致多種魚類發(fā)病死亡，嚴重威脅著世界魚類養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展(Inouyeet al,1992)。因此，真鯛虹彩病毒病長期以來被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)和中國列為魚類重要疫病(Junget al,2000; Rodgeet al,1997; Wenget al,2002; Chuaet al,1994)。

本研究通過疾病調(diào)查、病魚的臨床檢查、組織病理和超微病理觀察、病原初步篩查和分子生物學鑒定，確認感染褐龍斑的病毒為真鯛虹彩病毒，可為該病的深入研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

發(fā)病瀕死和健康的褐龍斑均取自山東省某石斑魚養(yǎng)殖場。TSA、TCBS培養(yǎng)基購自北京陸橋生物制品有限公司，海洋動物組織DNA提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，ExTaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker購自TaKaRa公司；所用引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2 疾病調(diào)查與臨床檢查

調(diào)查養(yǎng)殖環(huán)境及病魚死亡情況；觀察病魚活動情況，對瀕死病魚進行觀察和剖檢。

1.3 組織病理及超微病理觀察

參照史成銀(2004)的方法，取瀕死病魚和健康魚的肝、脾、腎、頭腎、鰓、心臟、胃和腸道組織制成石蠟切片和超薄電鏡切片，利用光學、透射電子顯微鏡觀察拍照。

1.4 寄生蟲觀察和細菌分離

取瀕死病魚的鰓絲、體表黏液制成水浸壓片，顯微鏡下觀察。使用病魚的肝、腎、脾接種TSA和TCBS平板后，28℃培養(yǎng)48 h，觀察細菌生長情況，進行細菌檢測。

1.5 組織DNA提取和PCR檢測

提取瀕死病魚脾、肝、頭腎和腎組織的 DNA，根據(jù)中華人民共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準《真鯛虹彩病毒病檢疫技術(shù)規(guī)范》(SN/T 1675-2014)，使用引物1-F/1-R和4-F/4-R進行PCR檢測(表1)。50 μl的 PCR 反應(yīng)體系：10×Reaction buffer(含 20 mmol/L Mg2+) 5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，20μmol/L引物各1μl，5 U/μlTaq酶 1 μl，100 ng/μl的模板 DNA 4 μl，補足超純水至 50 μl。PCR 反應(yīng)程序：95℃預變性 2 min；94℃ 30 s，58℃ 60 s，72℃ 60 s，共進行 30個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。

表1 本研究中的PCR引物序列及其目標產(chǎn)物大小Tab.1 Sequences of PCR primers and products length in this study

1.6 虹彩病毒MCP全長基因的擴增

參照史成銀(2004)，用引物 MCP-iridoF和MCP-iridoR 擴增 MCP 基因全長(表1)。50 μl的 PCR反應(yīng)體系：10×Reaction buffer (含 20 mmol/L Mg2+) 5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 4 μl，20 μmol/L引物各1μl，5 U/μlTaq酶 1 μl，100 ng/μl的模板 DNA 4 μl，補足超純水至 50 μl。PCR 反應(yīng)程序：94℃預變性 5 min；94℃ 2 min，57℃ 1 min，72℃ 1 min，35 個循環(huán)；最后，72℃延伸5 min。用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢查結(jié)果。PCR產(chǎn)物由上海生工生物技術(shù)有限公司從兩端單向測通，再拼接出完整的PCR產(chǎn)物序列，用Blast比對分析測序結(jié)果。

1.7 虹彩病毒的系統(tǒng)發(fā)育分析

依據(jù)Blast比對結(jié)果，選取18種(株)具有代表性的虹彩病毒，從GenBank下載各病毒的MCP基因全長序列，用MEGA 7.0構(gòu)建虹彩病毒系統(tǒng)發(fā)育樹，分析、鑒定感染褐龍斑的病毒在虹彩病毒科中的分類地位。各病毒的名稱及GenBank登錄號為：ATV (NC_ 005832)、CIV (AF303741)、FLIV-JJY (AY633990)、FV3 (U36913)、GIV (AY666015)、IIV-3 (DQ643392)、ISKNV (NC_003494)、ISKNV SB04 (KY440040)、LCDV-1 (NC_001824)、LCDV-C (AY380826)、RSIV-1 (AB666328)、RSIV 2HSB (AB666318)、RSIV-8 (AB666335)、RSIV-9 (AB666336)、RSIV 10GG (AB666324)、RSIV Ehime-1 (AB080362)、RSIV TGA14 (AB666320)、TRBIV (GQ273492)。

2 結(jié)果

2.1 疾病調(diào)查與臨床檢查

褐龍斑以循環(huán)水工廠化養(yǎng)殖，發(fā)病時的水溫為28℃、鹽度為31、pH為7.5、溶氧為4.5 mg/L、養(yǎng)殖密度為1000尾/40 m3。發(fā)病初期，病魚活力明顯下降。隨病程發(fā)展，病魚反應(yīng)遲鈍、伏底，并出現(xiàn)死亡。4個發(fā)病池，日死亡率約10%，10 d內(nèi)累積死亡率達80%。

病魚為2齡魚，全長為29.5～31.5 cm，體重約為500 g。多數(shù)魚體表未見明顯異常，個別魚尾鰭有潰瘍病灶。病魚鰓絲鮮紅，無潰爛(圖1A)。解剖可見病魚空腸空胃，無明顯發(fā)炎。肝局部出血，呈現(xiàn)不均勻的顏色。脾和腎嚴重腫大、易碎，腎臟色淡(圖1B)。

2.2 組織病理觀察

圖1 患病褐龍斑Fig.1 Diseased fish

圖2 患病魚組織病理變化(標尺為 20 μm)Fig.2 Histopathological changes in the diseased fish (Bar=20 μm)

健康魚脾實質(zhì)細胞飽滿、清晰、排列緊密(圖2A)。病魚脾組織細胞壞死，被大量紅細胞浸潤，出現(xiàn)嚴重淤血。組織中填充有大量嗜堿性的腫大細胞，直徑為10～15 μm，細胞質(zhì)均一化(圖2B)。脾出現(xiàn)大量鐵血黃素沉積(圖2C)。健康魚的頭腎呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(圖2D)。病魚的頭腎組織中可見大量嗜堿性的腫大細胞(圖2E)，且組織結(jié)構(gòu)松散，大量細胞發(fā)生核固縮，紅細胞浸潤，多見細胞崩解后形成的壞死灶(圖2F)。健康魚肝臟細胞大小、形狀均一，結(jié)構(gòu)清晰排列緊密 (圖2G)。病魚肝臟細胞膜崩解，邊界模糊，細胞連成一片，造成雙核假象；細胞核腫大而核質(zhì)溶解呈透亮狀；肝血竇周圍細胞發(fā)生淀粉樣變性，胞質(zhì)呈現(xiàn)云霧狀的嗜酸性染色(圖2H)。病魚肝臟內(nèi)可見局灶性壞死，并零星出現(xiàn)嗜堿性的腫大細胞(圖2I)。健康魚的腎組織結(jié)構(gòu)飽滿、清晰(圖2J)。病魚的腎造血組織壞死、細胞核固縮；出現(xiàn)嗜堿性的腫大細胞，但數(shù)量比脾和頭腎組織中少。病魚腎小管上皮細胞腫脹，細胞核空泡化(圖2K)。腎小球血管球細胞水樣變性，腎小囊腔變窄(圖2L)。健康魚鰓上皮細胞單層有序排列，次級鰓絲結(jié)構(gòu)清晰(圖2M)。病魚鰓組織結(jié)構(gòu)松散，次級鰓絲腫脹(圖2N)，且上皮細胞剝離、脫落；部分柱細胞斷裂，導致毛細血管擴張癥(圖2O)。健康魚心肌細胞結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整(圖2P)。病魚心肌纖維結(jié)構(gòu)松散、紊亂，心肌退化變性，胞質(zhì)液化呈均質(zhì)玻璃樣物質(zhì)。嚴重者心肌細胞壞死，細胞崩解留下帶狀壞死灶(圖2Q)。病魚腸組織病變不明顯；腸黏膜固有層零星出現(xiàn)細胞質(zhì)均一、嗜堿性的腫大細胞，細胞核固縮于細胞邊緣，或異常腫大，核質(zhì)溶解呈透亮狀(圖2R、圖2S)。病魚胃黏膜下層退化變性，細胞出現(xiàn)壞死崩解，留下不規(guī)則的壞死灶(圖2U)。

2.3 超微病理觀察

透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病魚脾造血組織細胞核異染色質(zhì)增多，核膜可見但不清晰，核周隙明顯擴張，嚴重者細胞核碎裂。細胞質(zhì)中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡化，線粒體腫脹、嵴消失(圖3A)。腫大細胞胞質(zhì)中存在大量虹彩病毒樣病毒粒子，無囊膜，直徑為 130～150 nm (圖3B)。病魚頭腎造血組織中發(fā)現(xiàn)含有大量病毒顆粒的腫大細胞，且線粒體腫脹、嵴消失，細胞質(zhì)中囊泡增多；特別是腫大細胞的細胞膜內(nèi)陷形成大量樹枝狀溝回結(jié)構(gòu)(圖3C)。出現(xiàn)核固縮的凋亡小體(圖3D)。病魚肝細胞膜出現(xiàn)破損或結(jié)構(gòu)異常，核內(nèi)大部分染色質(zhì)溶解，核外形可見，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡化形成的小泡脫粒、破裂，線粒體破損；嚴重者細胞核消失，出現(xiàn)嗜鋨性髓鞘樣小體，胞內(nèi)模糊不清，結(jié)構(gòu)基本消失(圖3E、圖3F)。病魚腎小管上皮細胞核固縮或出現(xiàn)核溝，細胞內(nèi)出現(xiàn)初級溶酶體，線粒體嵴腫脹呈管泡狀，刷狀緣發(fā)生斷裂(圖3G)。腎造血組織腫大細胞的細胞膜內(nèi)陷，核形狀異常，核仁增大(圖3H)。病魚次級鰓絲上皮細胞、柱狀細胞病變嚴重。線粒體嵴腫脹、空泡化，基質(zhì)電子密度增大；出現(xiàn)S或Y形的畸形線粒體，以及大量縱向嵴線粒體；細胞核周間隙擴張，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊泡化并脫粒(圖3I、圖3J)。病魚鰓血管及白細胞中觀察到大量的病毒粒子(圖3K、圖3L)，表明病毒可經(jīng)由血液循環(huán)感染魚體各個組織。病魚心肌細胞出現(xiàn)灶性溶解損傷，可見大量初級溶酶體(圖3M)。血管及白細胞中可見零星的病毒粒子(圖3N、圖3O)。心肌細胞的線粒體損傷，出現(xiàn)大量髓樣體(圖3P)。還可見許多縱向嵴、嵴溶解和形狀畸形的線粒體(圖3Q)。

2.4 寄生蟲檢查和細菌分離

所檢患病褐龍斑均未觀察到寄生蟲。病魚的肝、腎、脾接種的TSA和TCBS培養(yǎng)基上僅長出零星的菌落，非細菌性疾病特征。經(jīng)16S rDNA測序鑒定，分別為哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、弧菌(Vibriospp.)、美人魚發(fā)光桿菌(Photobacterium damselae)、假交替單胞菌(Pseudoalteromonassp.)、交替單胞菌(Alteromonassp.)、亞硫酸鹽桿菌(Sulfitobactersp.)等。

2.5 病魚組織的PCR檢測

3尾病魚的脾、頭腎等組織，用引物1-F/1-R和4-F/4-R進行PCR檢測，結(jié)果均為強陽性，而健康褐龍斑未擴增出任何條帶(圖4、圖5)。依據(jù)行業(yè)標準SN/T 1675-2014，可初步判定在褐龍斑各組織中發(fā)現(xiàn)的病毒為RSIV。

2.6 感染褐龍斑的虹彩病毒分類鑒定

從病魚脾組織中擴增得到了病毒(命名為LZ170711株)DNA 片段，長度為 1581 bp。經(jīng) Blast 比對分析，該序列包含MCP基因完整的編碼區(qū)及其上游57個、下游162個核苷酸。其中，MCP基因編碼區(qū)全長為1362 bp，編碼453個氨基酸。

與GenBank數(shù)據(jù)庫中18種(株)虹彩病毒的相應(yīng)序列進行比對發(fā)現(xiàn)，LZ170711株與細胞腫大病毒屬虹彩病毒各毒株相似性在94%以上；而與蛙病毒屬、淋巴囊腫病毒屬、綠虹彩病毒屬和虹彩病毒屬虹彩病毒各毒株的相似性均在 55%以下。在細胞腫大病毒屬內(nèi)，與 RSIV各分離株相似性均超過 97%，與ISKNV和 TRBIV的各分離株相似性為 94.5%～ 95.1%。LZ170711 與 RSIV TGA14、RSIV 10GG、RSIV-8、RSIV-9的MCP基因序列完全一致，與RSIVEhime-1、RSIV 2HSB株有9個核苷酸的差異，相似性為97.9%。

圖3 病魚的超微病理變化(標尺為 1 μm) Fig.3 Ultrastructural changes in the diseased fish (Bar=1 μm)

圖4 使用引物1-F/1-R檢測患病和健康褐龍斑Fig.4 PCR results of diseased and healthy fish using primer 1-F/1-R

圖5 使用引物4-F/4-R檢測患病和健康褐龍斑Fig.5 PCR results of diseased and healthy fish using primer 4-F/4-R

依據(jù)上述結(jié)果，用Mega 7軟件構(gòu)建了包含19種(株)虹彩病毒的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖6)。從圖6可以明顯看出，這些虹彩病毒分為5個病毒屬，LZ170711株位于細胞腫大病毒屬內(nèi)，且與RSIV各分離株的關(guān)系最近。

3 討論

魚類感染了腫大細胞虹彩病毒后，通常會體色變暗、游動異常、反應(yīng)遲鈍、嗜睡，且出現(xiàn)脾、腎組織腫大等癥狀(王慶等,2010; 何建國等,1998)。本研究發(fā)現(xiàn)，患病褐龍斑反應(yīng)遲鈍，脾、腎腫大，且脾質(zhì)地易碎。類似的病癥在患病尖吻鱸(Lates calcarifer)和褐籃子魚(Siganus fuscescens)中也有報道(文琳等,2015; 雷燕等,2014)。這些癥狀可用于腫大細胞虹彩病毒病的預警和初步診斷。

在組織病理方面，觀察到病魚各組織中存在細胞變性、凋亡等由病毒感染引起的典型病變。病魚脾和頭腎是腫大細胞虹彩病毒的靶器官，病理切片中可見大量嗜堿性、勻質(zhì)化、直徑為15～20 μm的腫大細胞，是該病的重要病理特征(Jancovichet al,2012)。通過超薄切片的電鏡觀察，在脾臟、頭腎的腫大細胞中發(fā)現(xiàn)大量裝配完成尚未釋放的病毒粒子。令人感興趣的是，在電鏡超薄切片中，經(jīng)?？梢杂^察到腫大細胞的細胞膜具有大量的樹枝狀溝回結(jié)構(gòu)，其形成原因和生理學意義尚不清楚，值得進一步研究。此外，在病魚心臟和鰓的血管、白細胞內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了一定數(shù)量的病毒粒子，表明腫大細胞虹彩病毒可以通過血液循環(huán)在魚體各器官和組織內(nèi)擴散(秦蕾等,2009)。尤其值得指出的是，一方面，本研究發(fā)現(xiàn)患病褐龍斑出現(xiàn)明顯的心肌萎縮、斷裂、間隙變大等病理特征，與此前報道的感染了虹彩病毒的條石鯛(Oplegnathus fasciatus)心臟病理特征一致(李華等,2011)。另一方面，在超薄切片中觀察到，病魚心肌細胞的線粒體病變明顯。大量的心肌細胞線粒體或出現(xiàn)縱向嵴，或退化成同心圓狀的髓樣體，意味著其呼吸功能的嚴重喪失。綜合上述病理特征，病魚心臟出現(xiàn)了嚴重的病理損傷，影響了魚體的血液循環(huán)，造成供氧不足，由此導致病魚表現(xiàn)出游泳無力、反應(yīng)遲鈍、嗜睡等表觀癥狀。

圖6 依據(jù)MCP基因構(gòu)建的19種(株)虹彩病毒系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic tree of 19 iridovirus isolates (strains) based on the complete coding sequence of MCP gene

MCP是虹彩病毒最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，其基因既高度保守，又有足夠的變異性，可以充分反映虹彩病毒的演化關(guān)系，是虹彩病毒分類鑒定的重要依據(jù)(Inouyeet al,1992; Chouet al,1998)。本研究測定并分析了感染褐龍斑的虹彩病毒的MCP基因，構(gòu)建了虹彩病毒系統(tǒng)發(fā)育樹，證實該病毒在分類地位上屬于虹彩病毒科細胞腫大病毒屬真鯛虹彩病毒類群。感染褐龍斑的該病毒與感染真鯛(Pagrus major)的RSIV-8、感染高體(Seriola dumerili)的 RSIV-9、感染斜帶石斑魚(E.coioides)的 RSIV 10GG、感染褐點石斑魚 (E.fuscoguttatus)的RSIV TGA14，其MCP基因編碼區(qū)全序列完全一致，可以認為它們是同一種病毒。這表明RSIV的敏感宿主范圍很廣，其對多種海水魚類均具有極強的致病性。RSIV對褐龍斑的致病性此前未見有報道，有待深入研究。