林詩(shī)涵

（福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院 國(guó)家加工食品監(jiān)督檢驗(yàn)中心[福州]，福建 福州 350002）

食源性致病菌，是指可以引起食物中毒或以食品為傳播媒介的致病性細(xì)菌。食源性致病菌約有幾十種，通常易引發(fā)食源性疾病的致病菌主要有以下7種[1,2]：致病性大腸埃希菌、沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界上70%的食源性疾病均由致病微生物所引發(fā)。近年來(lái)，部分畜牧業(yè)生產(chǎn)者片面追求產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，違規(guī)使用違禁藥品，給人類(lèi)健康帶來(lái)危害。2017年6月22日農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)了《全國(guó)遏制動(dòng)物源細(xì)菌耐藥行動(dòng)計(jì)劃（2017-2020年）》，并提出推進(jìn)獸用抗菌藥物減量化使用、優(yōu)化獸用抗菌藥物品種結(jié)構(gòu)等5條行動(dòng)目標(biāo)[3]。而中草藥作為我國(guó)傳統(tǒng)的藥用資源，具有療效可靠、抗菌、毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)[4,5]，是篩選高效、安全抗菌藥物的重要來(lái)源。

白頭翁湯始載于張仲景的《傷寒論·厥陰篇》，“熱利下重者，白頭翁湯主之”，是一味經(jīng)典的熱毒下痢良方?，F(xiàn)代藥效學(xué)研究表明，白頭翁湯具有抗菌、抗炎、抗?jié)?、促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)、抑制動(dòng)物腸管運(yùn)動(dòng)、抗腹瀉、對(duì)抗內(nèi)毒素對(duì)機(jī)體的損害的功效[6]。對(duì)于細(xì)菌性痢疾[7-8]和潰瘍性結(jié)腸炎[9]有著良好的治療效果。另外，在畜牧醫(yī)學(xué)上也可用于治療動(dòng)物痢疾，比如豬痢[10]和牛痢[1]。本實(shí)驗(yàn)選擇鼠傷寒沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌為對(duì)象，進(jìn)行白頭翁湯劑的體外抑制試驗(yàn)，旨在為后續(xù)食源性疾病的臨床用藥和研究提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材

白頭翁、黃柏、黃連、秦皮購(gòu)于福建中醫(yī)藥大學(xué)承創(chuàng)堂藥店，由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院鑒定。

1.1.2 菌種

鼠傷寒沙門(mén)氏菌（CGMCC1.1174）購(gòu)置于中國(guó)微生物菌種保存中心；志賀氏菌（ATCC25931）和金黃色葡萄球菌（ATCC25923）購(gòu)置于北京陸橋責(zé)任有限公司。

上述菌種由福建省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院微生物室鑒定并保存（菌種代數(shù)＜5代）。

1.1.3 試劑

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰酪胨大豆肉湯（TSB肉湯）、Mueller-Hintonation肉湯（M-H肉湯）、血平板、氯化鈉、環(huán)丙沙星和75%乙醇。

1.1.4 儀器

AF-20中藥粉碎機(jī)、索氏提取裝置、HB 10 S96旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、115043真空泵、DLIO-1000液循冷卻器、HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋、HVE-50自動(dòng)高壓滅菌器、電熱鼓風(fēng)干燥箱、LRH系列37℃恒溫培養(yǎng)箱、QT-1旋渦混合器、FG101727游標(biāo)卡尺、Whatman’s No.06無(wú)菌定性濾紙和6 mm打孔器，等。

1.2 方法

1.2.1 藥液的制備

取白頭翁15 g，黃柏12 g，黃連6 g，秦皮12 g置于中藥打粉機(jī)中粉碎至粗粉狀。將藥材粗粉放進(jìn)濾紙筒內(nèi)，輕壓使其平實(shí)后將濾紙筒裝入索氏提取器，用8倍量的75%乙醇回流提取1 h，重復(fù)3次，合并提取液，減壓抽濾；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮，至無(wú)醇味。將藥液濃縮至流浸膏狀（每1 mL約含原藥材1 g），作為供試藥液[11]。

1.2.2 菌液的制備

將鼠傷寒沙門(mén)氏菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株劃線接種到血平板上，置于37 ℃下恒溫培養(yǎng)24 h，挑選適宜的菌落接種到10 ml的TSB肉湯中，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)24 h。

將培養(yǎng)好的菌懸液稀釋至1麥?zhǔn)蠞岫龋?xì)菌濃度約1×108 CFU/mL），4 ℃冷藏備用[12]。

志賀氏菌、金黃色葡萄球菌樣液依照同樣的方法制備。

1.2.3 含菌培養(yǎng)皿的制備

傾注融化并冷卻至46 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15 mL于無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)，制成營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板。分別取上述制備好的菌懸液稀釋至106 CFU/mL菌含量，與冷卻至46 ℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基按1∶10的比例混合，充分混勻后取10 mL于上述制備好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，輕輕搖動(dòng)平板使菌液均勻鋪平，制成含菌平板。

1.2.4 K-B紙片法[13]抑菌試驗(yàn)

每個(gè)含菌平板上貼3張空白圓紙片，使3張圓紙片呈正三角形分布，且每張紙片的距離不小于32 mm，分別吸取10 μL的供試藥液、濃度為50 μg/mL的環(huán)丙沙星溶液和0.85%生理鹽水緩緩滴加在圓紙片上，使其充分吸收，每種菌做2個(gè)平行樣。

將平板置于4 ℃的冰箱中活化2 h，后轉(zhuǎn)入37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，正置培養(yǎng)24 h。觀察并用游標(biāo)卡尺測(cè)量所形成的抑菌圈的直徑大小，采用十字交叉法，測(cè)量3次，取平均值[14]。

1.2.5 最小抑菌濃度（MIC）及最小殺菌濃度（MBC）測(cè)定

采用二倍稀釋法[15]測(cè)定。取10支滅菌M-H肉湯試管，編號(hào)1～10#。1～8#試管加入1 mL等比濃度的白頭翁湯劑，使1～8#小試管濃度分別為0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.015625、0.0078125、0.00390625 g/mL。取供試菌液（細(xì)菌濃度約106CFU/mL）1 mL分別加入1～9#，9#為不加供試藥液的陽(yáng)性對(duì)照，10#加入供試白頭翁藥液，作為不加供試菌液的陰性對(duì)照。

將10支試管于37 ℃的恒溫培養(yǎng)24 h后取出，充分混合均勻后，用移液槍吸取100μL混合液，于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上面，均勻涂布，至液體完全吸收。放置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出并觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)情況，無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)試管清澈透明的最低藥物濃度為藥物對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度（MIC），以肉眼觀察細(xì)菌被100%滅殺的濃度為藥物對(duì)細(xì)菌的最小殺菌濃度（MBC）。

2 結(jié)果

2.1 K-B紙片法抑菌結(jié)果

白頭翁湯劑對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用見(jiàn)表1。抑菌圈直徑＞20 mm 為高度敏感（+++），15～20 mm 為中度敏感（++），8～15 mm 為輕度敏感（+），＜8 mm為耐藥或無(wú)抑制活性（-）[14]。

2.2 白頭翁湯劑的最小抑菌濃度和最小殺菌濃度

2.2.1 鼠傷寒沙門(mén)氏菌的MIC和MBC結(jié)果

1#鼠傷寒沙門(mén)氏菌M-H肉湯試管肉湯澄清，2～8#試管肉湯渾濁，9#陽(yáng)性對(duì)照管肉湯渾濁，10#陰性對(duì)照管肉湯澄清。對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，1#平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，2#平板呈零星生長(zhǎng)，3#平板呈分散生長(zhǎng)，4～8#平板細(xì)菌連片生長(zhǎng)，9#平板細(xì)菌連片生長(zhǎng)，10#平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)表2。白頭翁湯劑對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌的MIC=0.125 g/mL、MBC=0.5 g/mL。

2.2.2 志賀氏菌的MIC和MBC結(jié)果

1、2 #志賀氏菌M-H肉湯試管肉湯澄清，3～8#試管肉湯渾濁，9#陽(yáng)性對(duì)照管肉湯渾濁，10#陰性對(duì)照管肉湯澄清。對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，1和2#平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，3#平板呈零星生長(zhǎng)，4#平板呈分散生長(zhǎng)，5～8#平板細(xì)菌連片生長(zhǎng)，9#平板細(xì)菌連片生長(zhǎng)，10#平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)表2。白頭翁湯劑對(duì)于志賀氏菌的MIC=0.0625 g/mL、MBC=0.25 g/mL。

2.2.3 金黃色葡萄球菌的MIC和MBC結(jié)果

1、2 #金黃色葡萄球菌M-H肉湯試管肉湯澄清，2～8#試管肉湯渾濁，9#陽(yáng)性對(duì)照管肉湯渾濁，10#陰性對(duì)照管肉湯澄清。對(duì)應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，1和2#平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，3～6#平板呈分散生長(zhǎng)，但隨著藥液濃度的稀釋?zhuān)瘘S色葡萄球菌菌落數(shù)遞增， 7、8#平板上金黃色葡萄球菌連片生長(zhǎng)，9#平板細(xì)菌連片生長(zhǎng)，10#平板無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，結(jié)果見(jiàn)表2。白頭翁湯劑對(duì)于金黃色葡萄球菌的MIC=0.015625 g/mL、MBC=0.25 g/mL。

3 討論

微生物耐藥性和抗生素濫用以及不斷增加的不良反應(yīng)已成為全球關(guān)注的嚴(yán)峻問(wèn)題，許多新的病原微生物和耐藥菌的產(chǎn)生對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康造成極大威脅。因此，防止微生物耐藥性產(chǎn)生和尋找特效抗菌藥物成為當(dāng)務(wù)之急[16]。我國(guó)中草藥資源豐富，長(zhǎng)期使用較少產(chǎn)生耐藥性，不易出現(xiàn)殘留、抗藥性、毒副作用，具有安全性和可靠性，是其他抗生素?zé)o可比擬的[17]。

表1 白頭翁湯劑的K-B紙片抑菌結(jié)果

表2 白頭翁湯劑對(duì)3種致病菌的MIC、MBC測(cè)定結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)以鼠傷寒沙門(mén)氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌為供試菌，分別來(lái)測(cè)試白頭翁湯劑的抑菌活性。從結(jié)果中可以看出，白頭翁湯劑對(duì)志賀氏菌和金黃色葡萄球菌有明顯的效果，對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌效果較好，且抑菌效果與藥湯劑濃度無(wú)特定的比例關(guān)系。這可能是由于中草藥含有多種成分，而各成分的活性強(qiáng)度（抗菌能力）有所不同，以及抑菌機(jī)理的不同所致。

本實(shí)驗(yàn)白頭翁湯劑對(duì)挑選的3種致病菌的抗菌效果不能簡(jiǎn)單的以藥物的MIC和MBC來(lái)評(píng)價(jià)，而忽略了機(jī)體自身免疫機(jī)能的影響。本實(shí)驗(yàn)采用體外環(huán)境作為抑菌背景，而藥物的作用環(huán)境大多在機(jī)體內(nèi)部[18]，抑菌效果必然有所差異，需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的論證。可以預(yù)見(jiàn)的是，利用中草藥防治細(xì)菌性疾病，減少抗生素及化學(xué)合成藥物的使用，降低藥物殘留對(duì)人類(lèi)的危害，將是發(fā)展現(xiàn)代中藥學(xué)的必然趨勢(shì)。