李曉敏，穆 倩，周蘇陽(yáng)，范文宏,2

1.北京航空航天大學(xué)， 空間與環(huán)境學(xué)院， 北京 102206 2.北京航空航天大學(xué)， 醫(yī)工交叉北京市高精尖創(chuàng)新中心， 北京 100191

隨著納米材料在生活和生產(chǎn)領(lǐng)域越來(lái)越多地被制造和使用，不可避免會(huì)進(jìn)入到水環(huán)境中，近年來(lái)人工納米材料在水環(huán)境中的行為及其對(duì)水生生物的影響引起了人們的廣泛關(guān)注。研究表明，較高濃度的納米材料會(huì)對(duì)水生生物產(chǎn)生毒性。如納米二氧化鈦(TiO2)會(huì)對(duì)斑馬魚(yú)腸道和肝臟細(xì)胞產(chǎn)生氧化脅迫損傷，其96 h LC50(Lethal Concentration 50，半數(shù)致死濃度)為124.5 mg/L[1]。納米氧化鋁(Al2O3)對(duì)秀麗線蟲(chóng)的24 h LC50為82 mg/L[2]。納米氧化石墨烯會(huì)導(dǎo)致紋藤壺(AmphibalanusAmphitrite)游動(dòng)速度減緩和抑制攝食，其48 h LC50為560 mg/L[3]。實(shí)際水環(huán)境中納米材料的濃度較低[4]，對(duì)于水生生物的毒性并不高。然而，納米材料進(jìn)入水環(huán)境后，會(huì)與水中已存在的組分發(fā)生作用，如吸附、團(tuán)聚、沉降、絡(luò)合等，從而對(duì)水環(huán)境中原有污染物，如重金屬的毒性產(chǎn)生影響[5-7]。因此納米材料對(duì)于水中原有污染物毒性的影響成為納米材料毒性效應(yīng)研究的重點(diǎn)。

納米Al2O3由于其耐高溫、耐腐蝕、高吸附、高硬度等特性在微電子、化工、宇航工業(yè)等科技領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景[8-11]，預(yù)計(jì)年用量可達(dá)10萬(wàn)t以上[12]。研究表明，納米Al2O3本身對(duì)水生生物的毒性較低[1, 2, 13]，但是進(jìn)入水環(huán)境后對(duì)環(huán)境中原有污染物的毒性，如對(duì)重金屬鎘(Cd)表現(xiàn)出明顯影響。例如，納米Al2O3能夠顯著增強(qiáng)金屬Cd在銅銹環(huán)棱螺體內(nèi)的生物積累和氧化損傷[14]，可以有效減緩銅(Cu)對(duì)斜生柵藻(Scenedesmusobliquus)細(xì)胞的毒性[15]，對(duì)于鉻(IV)對(duì)斜生柵藻的毒性沒(méi)有顯著影響[16]。

納米材料對(duì)重金屬毒性的影響受到材料表面修飾、表面電荷、尺寸、親疏水性質(zhì)的影響[17]。例如親水型的納米顆粒相比較于疏水型的納米顆粒，更容易進(jìn)入細(xì)胞體內(nèi)[18]。如納米TiO2的親疏水性質(zhì)會(huì)影響大型溞對(duì)其生物利用度，親水型納米TiO2的生物積累高于疏水型的納米TiO2，這可能是由于親水型的納米TiO2更容易進(jìn)入大型溞腸道內(nèi)，而疏水型的納米TiO2更容易被大型溞排出體外，最終導(dǎo)致親水型的納米TiO2生物積累較高[19]。也有研究發(fā)現(xiàn)，納米TiO2老化后對(duì)大型溞的急性毒性與納米顆粒的親疏水性質(zhì)有關(guān)[20]。但納米Al2O3的親疏水性質(zhì)對(duì)重金屬毒性的影響，卻少有人報(bào)道。

本文選取斜生柵藻作為受試生物，研究親疏水改性后的γ型納米Al2O3存在下銅離子(Cu2+)對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)狀態(tài)、積累量、抗氧化酶活力的影響，通過(guò)不同親疏水性質(zhì)的納米Al2O3-Cu的復(fù)合暴露實(shí)驗(yàn)和納米Al2O3單獨(dú)暴露實(shí)驗(yàn)進(jìn)行比較分析，探討不同親疏水性質(zhì)的納米Al2O3存在下Cu對(duì)斜生柵藻的毒性，為納米材料的使用和管理提供理論基礎(chǔ)，為水生生物監(jiān)測(cè)提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 納米Al2O3的來(lái)源與性質(zhì)

納米Al2O3為宣城晶瑞新材料有限公司提供的氣相法制備的親水型納米Al2O3(H1)，液相法制備親水性質(zhì)的納米Al2O3(H2)和硅烷偶聯(lián)劑KH550處理后疏水性質(zhì)的納米Al2O3(L0)，其具體成分性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 3種納米Al2O3的性質(zhì)Table 1 Properties of three nano-Al2O3

1.2 受試微藻及培養(yǎng)條件

斜生柵藻購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院武漢水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行馴化、培養(yǎng)。馴化條件如下：采用BG11培養(yǎng)基(BG-11 Medium for Blue Green Algae，藍(lán)綠培養(yǎng)基)[21]，置于恒溫氣候箱中培養(yǎng)，溫度(23±1) ℃，光照強(qiáng)度131.4 μmol/(m2·s)，光暗周期12 h:12 h，靜置培養(yǎng)，每天定時(shí)人工搖動(dòng)3次。

1.3 實(shí)驗(yàn)介質(zhì)

本研究中，斜生柵藻的保種和擴(kuò)大培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基，其他實(shí)驗(yàn)(如吸附實(shí)驗(yàn)和毒性實(shí)驗(yàn))采用修改后的BG11培養(yǎng)基，具體見(jiàn)表2。參照YANG等[22]對(duì)WC培養(yǎng)基的修改，本研究去除原培養(yǎng)基中的乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)(1 mg/L)，避免其參與競(jìng)爭(zhēng)絡(luò)合金屬離子而影響之后實(shí)驗(yàn)；此外去除培養(yǎng)基中所有的痕量金屬，防止出現(xiàn)沉淀如錳離子(Mn2+)和排除培養(yǎng)基中原有Cu2+的干擾。

表2 修改后的BG11培養(yǎng)基Table 2 Modified BG11 medium mg/L

1.4 實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中3種納米Al2O3的理化性質(zhì)

將3種納米Al2O3分別加入到修改后的BG11培養(yǎng)基中，超聲10 min，配制成濃度均為1 000 mg/L 的母液備用。正式實(shí)驗(yàn)前，超聲振蕩30 min，使懸浮液分散均勻，用修改后的BG11培養(yǎng)基稀釋得到濃度均為1 mg/L的 H1、H2、L0。

為了探究不同親疏水性質(zhì)的納米Al2O3的穩(wěn)定性，取適量新配制的H1、H2、L0靜置，分別在0、24、48、96 h用納米粒度ZETA電位分析儀(Zetasizer Nano ZS，英國(guó))分析顆粒水力學(xué)尺寸和Zeta電位。

為探究H1、H2、L0的粒徑和形態(tài)，用聚醋酸甲基乙烯脂負(fù)載的銅網(wǎng)作為載體，用毛細(xì)管取適量溶液滴在銅網(wǎng)中間，放置于超凈臺(tái)內(nèi)，自然風(fēng)干后采用JEM-2100F型透射電鏡進(jìn)行拍攝觀察。

1.5 納米氧化鋁與銅離子的吸附實(shí)驗(yàn)

Cu2+濃度為0.5 mg/L，H1、H2、L0濃度為1 mg/L，每組均設(shè)2個(gè)平行，在150轉(zhuǎn)/min、25 ℃下振蕩6 h。在10、20、30、40、50、60、180、360 min取樣2 mL，于12 000轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清液用感應(yīng)耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)(VG PQ2 TURBO，英國(guó))測(cè)定Cu2+濃度。

1.6 暴露實(shí)驗(yàn)

取適量處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞以4 500轉(zhuǎn)/min離心15 min，用無(wú)菌修改后的BG11培養(yǎng)基清洗3次，按1.0×106cells/mL藻密度接種。設(shè)置4個(gè)陰性對(duì)照組、1個(gè)陽(yáng)性對(duì)照組、3個(gè)實(shí)驗(yàn)組，各組試劑組成情況見(jiàn)表3。其中不加納米材料和Cu2+的1組為陰性對(duì)照組a(Control)，只加入納米材料不加入Cu2+的3組為陰性對(duì)照組b(H1、H2、L0)，不加入納米材料只加入Cu2+的為陽(yáng)性對(duì)照組(Cu)，剩余3組為實(shí)驗(yàn)組(H1′、H2′、L0′)，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)，混合體系穩(wěn)定時(shí)間設(shè)置為3 h，暴露時(shí)間4 d。

表3 實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組試劑添加情況Table 3 Reagents addition and the contents of nano-Al2O3 in control groups and treatments mg/L

注：“*”陰性對(duì)照組a；“#”陰性對(duì)照組b；“**”陽(yáng)性對(duì)照組；“##”實(shí)驗(yàn)組。

每隔24 h取適量藻液，利用754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)測(cè)定藻液在650 nm處的吸光度，得到斜生柵藻的生長(zhǎng)情況。

每隔24 h取適量藻液，以4 500轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速離心15 min收集藻細(xì)胞，加入磷酸緩沖液(0.05 mol/L，pH7.8)，利用超聲波細(xì)胞破碎儀(寧波生物科技有限公司)冰浴破碎細(xì)胞，于12 000轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，取上清粗酶液，用SOD(超氧化物歧化酶)、GSH(谷胱甘肽)、MDA(丙二醛)試劑盒(南京建成生物工程研究所)參照測(cè)試盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定SOD活力和GSH、MDA的含量。

1.7 不穩(wěn)態(tài)銅及細(xì)胞內(nèi)銅積累量與鋁的富集量的測(cè)定

不穩(wěn)態(tài)銅的測(cè)定：每隔24 h取適量藻液，以4 500轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速離心15 min，取上清液以12 000轉(zhuǎn)/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液10 mL用伏安極譜儀(797VA computrace system)測(cè)不穩(wěn)態(tài)銅。測(cè)試條件和參數(shù)設(shè)置：懸汞電極作為工作電極；電解質(zhì)為氯化鉀(0.03 mol/L)；實(shí)驗(yàn)溫度為(23±1) ℃；掃描速率為15 mV/s；脈沖振幅為50 mV。測(cè)試前通高純氮?dú)?N2)除氧15 min。

暴露96 h后，取適量藻液，以4 500轉(zhuǎn)/min離心15 min，用10 mM的EDTA-Na2洗脫3次，加入1 mL濃硝酸消解，定容后用ICP-MS測(cè)定樣品中Cu2+、Al3+(鋁離子)濃度。接種后15 min以相同方法測(cè)定此時(shí)不能被EDTA-Na2洗脫的吸附的Cu2+。用96 h時(shí)的Cu2+含量扣除這部分吸附的Cu2+，得到真正吸收進(jìn)入細(xì)胞的銅的含量[22]。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用軟件SPSS Statistics 20中的LSD方法進(jìn)行單因素方差顯著性分析(one-way ANOVA)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用軟件Origin 8.0 進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 納米Al2O3在溶液中的存在狀態(tài)

動(dòng)態(tài)光散射(DLS，Dynamic Light Scattering)的表征結(jié)果如圖1(a)所示：3種納米Al2O3的平均水力學(xué)直徑隨著時(shí)間而迅速增大，但不同材料的增大幅度相差較為明顯。96 h后，H1增大到約為112 nm，H2增大到約為246 nm，L0增大到約為701 nm，并且均遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于實(shí)驗(yàn)所用的納米Al2O3的原始粒徑(均為20 nm)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同性質(zhì)的納米Al2O3在實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中的團(tuán)聚程度明顯不同。L0團(tuán)聚最為嚴(yán)重，H2次之，H1最小。

Zeta電位與納米材料的分散性和穩(wěn)定性密切相關(guān)。有研究表明，當(dāng)Zeta電位的絕對(duì)值大于30 mV時(shí)，溶液具有良好的穩(wěn)定性和分散性[23]。從圖1(b)中可以看出,3種納米Al2O3的Zeta電位隨時(shí)間略有增加，但整體上并沒(méi)有明顯差別，基本處于-18 mV左右。96 h時(shí)，H1、H2、L0的Zeta電位分別為-18.93、-18.63、-18.74 mV，絕對(duì)值均小于30 mV，再次證明3種性質(zhì)的納米Al2O3在實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中穩(wěn)定性較差，易于聚沉。3種性質(zhì)的納米Al2O3的團(tuán)聚程度還可以從透射電鏡(TEM)圖片(圖2)中得到證實(shí)，其中L0團(tuán)聚體粒徑最大，部分超過(guò)了400 nm(圖2c)。

圖1 不同性質(zhì)納米Al2O3顆粒在水中的平均水力學(xué)直徑及Zeta電位Fig.1 Properties of nano-Al2O3 in the exposure solution mean hydrodynamic diameter and zeta potential

圖2 不同性質(zhì)的納米Al2O3的TEM圖片F(xiàn)ig.2 Transmission electron microscope images of three nano-Al2O3

圖3顯示了納米Al2O3在實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中與Cu2+的吸附作用?？梢?jiàn)，納米Al2O3的存在均可使實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中Cu2+的含量迅速降低，并在較短時(shí)間內(nèi)(180 min)達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，但不同性質(zhì)的納米Al2O3之間并無(wú)顯著差異(p>0.05，one-way ANOVA)。180 min時(shí)，H1、H2、L0溶液中Cu2+的濃度分別降低為165.36、165.64、158.08 μg/L，同初始濃度相比較可以看到H1與H2對(duì)Cu2+的吸附作用相近，L0相對(duì)更強(qiáng)。

圖3 不同性質(zhì)的納米Al2O3對(duì)實(shí)驗(yàn)介質(zhì)中Cu2+的吸附作用Fig.3 Copper concentration after Cu2+ adsorption onto three nano-Al2O3 in the modified BG11 medium

2.2 納米Al2O3存在下Cu2+對(duì)斜生柵藻生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，不同親疏水性質(zhì)的納米Al2O3分別處理96 h后，實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組的生物量存在明顯差異(p<0.05，one-way ANOVA)，但是不同實(shí)驗(yàn)組之間并未表現(xiàn)出顯著差別(p>0.05，one-way ANOVA)；含有納米Al2O3的陰性對(duì)照組b和不含納米Al2O3的陰性對(duì)照組a的生物量未表現(xiàn)出明顯差異(p>0.05，one-way ANOVA)。

圖4 不同體系中斜生柵藻的生長(zhǎng)情況Fig.4 Growth of Scenedesmus obliquus exposed to copper and copper/nano-Al2O3 systems

與陰性對(duì)照組a相比，陽(yáng)性對(duì)照組中斜生柵藻的生長(zhǎng)受到明顯抑制，在96 h生長(zhǎng)抑制率達(dá)到36.7%，這說(shuō)明Cu2+在低濃度暴露下(0.5 mg/L)對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯的抑制作用；而陰性對(duì)照組b中藻細(xì)胞的生長(zhǎng)情況與之相近，這說(shuō)明低濃度的納米Al2O3(1 mg/L)對(duì)斜生柵藻的生長(zhǎng)沒(méi)有明顯的毒性。與陽(yáng)性對(duì)照組相比，加入3種不同的納米Al2O3的實(shí)驗(yàn)組中藻細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制均得到緩解，實(shí)驗(yàn)組中的藻細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率比陽(yáng)性對(duì)照組的生長(zhǎng)抑制率降低了約32.4%，這說(shuō)明3種性質(zhì)的納米Al2O3均可有效降低Cu2+的毒性，緩解Cu2+對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。培養(yǎng)4 d后，含有H1、H2、L0的實(shí)驗(yàn)組的生長(zhǎng)抑制率并無(wú)明顯差別，分別為24.6%、25.6%、24.2%。

2.3 金屬的生物可利用性

陽(yáng)極溶出伏安法(ASV)是痕量元素形態(tài)分析的有效技術(shù)手段，能夠準(zhǔn)確測(cè)定金屬不穩(wěn)態(tài)組分的含量[24]。圖5顯示了不同親疏水性質(zhì)的納米Al2O3存在下藻液內(nèi)不穩(wěn)態(tài)銅的濃度。由圖5可知，實(shí)驗(yàn)組與陽(yáng)性對(duì)照組中不穩(wěn)態(tài)銅的濃度變化趨勢(shì)相近，但濃度之間存在顯著差別(p<0.05，one-way ANOVA)，而不同實(shí)驗(yàn)組之間并未表現(xiàn)出明顯差別(p>0.05，one-way ANOVA)。0 h 時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組、含有 H1的實(shí)驗(yàn)組、含有 H2的實(shí)驗(yàn)組、含有 L0的實(shí)驗(yàn)組中的不穩(wěn)態(tài)銅的濃度分別為122.5、42.0、40.5、42.1 μg/L；處理24 h后，不穩(wěn)態(tài)銅的濃度快速降低，降低幅度分別為39.2%、13.1%、11.1%、14.3%；而在之后的72 h中，不穩(wěn)態(tài)銅的濃度降低幅度明顯減緩，96 h 時(shí)分別降至66.5、35.0、32.5、31.5 μg/L，這說(shuō)明納米Al2O3可以有效降低藻液中不穩(wěn)態(tài)銅的濃度。

圖5 不同性質(zhì)的納米Al2O3存在下藻液中不穩(wěn)態(tài)銅的濃度Fig.5 Concentration of labile copper exposed to copper and copper/nano-Al2O3 systems

圖6(a)顯示了銅在斜生柵藻中的積累情況?？梢钥闯?，暴露96 h后，在對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組中均有銅的積累。陰性對(duì)照組b與陰性對(duì)照組a中銅的積累無(wú)顯著差異(p>0.05，one-way ANOVA)，銅積累量在21.67～25.68 ng/mg(藻干重)。陽(yáng)性暴露組中銅的積累最大，為513.35 ng/mg(藻干重)，加入H1、H2、L0后Cu積累分別降低了76.56%、76.15%、76.69%，降低顯著(p<0.05，one-way ANOVA)，但不同納米Al2O3體系之間并未表現(xiàn)出明顯差異(p>0.05，one-way ANOVA)，銅積累量分別為120.36、122.45、119.65 ng/mg(藻干重)。這說(shuō)明納米Al2O3的加入可以明顯降低銅在藻細(xì)胞中的積累量，親水性質(zhì)的H1、H2和疏水性質(zhì)的L0對(duì)降低銅的積累量的作用差別不明顯。

斜生柵藻對(duì)納米Al2O3的富集，包括細(xì)胞表面粘附和內(nèi)吞的顆粒2部分。圖6(b)顯示了鋁在斜生柵藻上的富集情況?？梢钥闯觯┞?6 h后，在對(duì)照組與各實(shí)驗(yàn)組中都有鋁的富集。陰性對(duì)照組a和陽(yáng)性對(duì)照組中鋁的含量較低且無(wú)明顯差異(p>0.05，one-way ANOVA)，陰性對(duì)照組b和實(shí)驗(yàn)組之間鋁的富集較高且無(wú)明顯差異(p>0.05，one-way ANOVA)，并且不同實(shí)驗(yàn)組之間也無(wú)顯著差別(p>0.05，one-way ANOVA)。藻細(xì)胞富集的納米Al2O3主要可能是吸附于細(xì)胞表面的部分，并且藻細(xì)胞對(duì)納米材料的吸附是比較顯著的。其他研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，納米顆粒與藻細(xì)胞表面存在相互作用[25]。有研究發(fā)現(xiàn)月牙藻(Pseudokirchneriellasubcapitata)細(xì)胞表面能攜帶超過(guò)自身重量2.3倍的納米顆粒[26]。

圖6 斜生柵藻細(xì)胞中銅和鋁的積累量Fig.6 Cu and Al accumulation in algae cells

2.4 納米Al2O3對(duì)斜生柵藻細(xì)胞內(nèi)SOD活性和GSH、MDA含量的影響

測(cè)試了暴露于修改后的BG11培養(yǎng)基、3種納米Al2O3、Cu2+和Cu2+-納米Al2O3體系下斜生柵藻細(xì)胞中SOD活性隨時(shí)間的變化，見(jiàn)圖7。由圖7(a)可以看出，4組處理組中藻體的SOD活性均隨著暴露時(shí)間的增加逐漸增加，H1、H2、L0與對(duì)照組間不存在顯著差別(p>0.05，one-way ANOVA)。

從圖7(b) 可以看出，4組處理組中藻體的SOD活性先增加后減小，陽(yáng)性暴露組的SOD活性在48 h后快速下降，與實(shí)驗(yàn)組存在明顯差別(p<0.05，one-way ANOVA)，這說(shuō)明Cu2+處理后的藻細(xì)胞的SOD活性被顯著抑制，48 h時(shí)SOD活性達(dá)到最大值29.75 U/mgprot，之后逐漸降低，96 h降至最低值19.95 U/mgprot。而含有納米Al2O3的Cu2+暴露體系的藻細(xì)胞SOD活性在48 h后相比陽(yáng)性暴露組下降明顯減緩，而不同實(shí)驗(yàn)組之間SOD活性的變化趨勢(shì)基本一致(p>0.05，one-way ANOVA)。

圖7 不同暴露條件下斜生柵藻的SOD活性Fig.7 SOD activities in Scenedesmus oliquus exposed to copper and copper/nano-Al2O3 systems

從圖8(a)可以看到，經(jīng)3種納米Al2O3處理的斜生柵藻內(nèi)GSH含量與對(duì)照組沒(méi)有明顯差別(p>0.05，one-way ANOVA)。當(dāng)藻細(xì)胞單獨(dú)暴露于納米Al2O3時(shí)，其GSH含量隨著時(shí)間沒(méi)有明顯改變(p>0.05，one-way ANOVA)。從圖8(b)可以看出，當(dāng)藻細(xì)胞暴露于Cu2+時(shí)，GSH含量隨著時(shí)間逐漸增加，且GSH含量明顯高于含有納米Al2O3的Cu2+暴露組(p<0.05，one-way ANOVA)，但是不同納米Al2O3的Cu2+暴露組之間GSH含量并沒(méi)有顯著差別(p>0.05，one-way ANOVA)。96 h時(shí)，Cu2+、Cu2+-H1、Cu2+-H2、Cu2+-L0處理組中GSH含量分別為4.06、2.51、2.53、2.42 mg/gprot。

圖8 不同暴露條件下斜生柵藻的GSH含量Fig.8 GSH concentrations in Scenedesmus oliquus exposed to copper and copper/nano-Al2O3 systems

MDA不僅是自由基損傷脂質(zhì)的生物標(biāo)記，也是細(xì)胞膜損傷的指示[27]。從圖9(a)可以看出，當(dāng)藻細(xì)胞單獨(dú)暴露于3種納米Al2O3時(shí)，其MDA含量隨著時(shí)間沒(méi)有明顯改變(p>0.05，one-way ANOVA)，且與對(duì)照組不存在顯著差別(p>0.05，one-way ANOVA)。

從圖9(b)可以看出，含有納米Al2O3的Cu2+暴露組與Cu2+單獨(dú)暴露組MDA的含量不存在明顯的差別(p>0.05，one-way ANOVA)，并且3種納米Al2O3之間沒(méi)有顯著差別(p>0.05，one-way ANOVA)，藻細(xì)胞的MDA含量均隨著時(shí)間緩慢增加。96 h時(shí)，Cu2+、Cu2+-H1、Cu2+-H2、Cu2+-L0處理組中MDA含量分別為23.2、22.0、22.5、22.3 nmol/mgprot。

圖9 不同暴露條件下斜生柵藻的MDA含量Fig.9 MDA concentrations in Scenedesmus oliquus exposed to copper and copper/nano-Al2O3 systems

2.5 納米Al2O3的親疏水性質(zhì)對(duì)水體中銅的生物毒性的影響

氧化應(yīng)激是評(píng)價(jià)納米材料水生毒性機(jī)理的重要內(nèi)容。根據(jù)氧化應(yīng)激分級(jí)假說(shuō)，最低程度的氧化應(yīng)激與抗氧化劑和具有解毒作用的酶有關(guān)；較高程度的氧化應(yīng)激表明炎癥和細(xì)胞毒性超過(guò)了這種保護(hù)響應(yīng)的能力[28]。從SOD活性、GSH含量、MDA含量隨時(shí)間的變化來(lái)看，1 mg/L不同親疏水性質(zhì)的納米Al2O3單獨(dú)存在不會(huì)對(duì)斜生柵藻產(chǎn)生明顯的毒性效應(yīng)，但是分別含有親、疏水性質(zhì)的納米Al2O3的Cu2+暴露體系不同，其斜生柵藻抗氧化反應(yīng)可以分為2個(gè)階段：第一階段(0—72 h)，暴露開(kāi)始后，Cu2+通過(guò)酶反應(yīng)和非酶反應(yīng)，產(chǎn)生O2-·、1O2、·OH、LO·、LOO·、LOOH，生物體內(nèi)抗氧化體系被激活，SOD活性、GSH含量明顯增加，開(kāi)始清除自由基；第二階段(72—96 h)，由于進(jìn)入細(xì)胞的污染物不能被及時(shí)清除，持續(xù)誘導(dǎo)自由基產(chǎn)生，超過(guò)了細(xì)胞氧化應(yīng)激的限度，SOD活性被抑制，GSH、MDA含量持續(xù)增加。僅含有Cu2+的暴露體系中SOD活性在48 h就開(kāi)始被抑制，而含有納米材料的Cu2+暴露體系72 h后開(kāi)始被抑制，可見(jiàn)納米材料的加入緩解了Cu2+對(duì)藻細(xì)胞的毒性。

痕量金屬對(duì)水生生物的生物有效性和毒性依賴于金屬的物理化學(xué)形態(tài)，測(cè)定金屬的形態(tài)比金屬的總濃度更有助于探究金屬對(duì)水生生物的影響[29-30]。ASV測(cè)得的不穩(wěn)態(tài)銅包括Cu2+和易于解離的銅復(fù)合體，這些被認(rèn)為是生物可利用的部分[24, 31]。ASV測(cè)得的不穩(wěn)態(tài)銅的濃度與毒性之間的相關(guān)性有利于預(yù)測(cè)銅對(duì)水生生物的毒性。圖10是不同性質(zhì)的納米Al2O3存在下以比生長(zhǎng)率為基礎(chǔ)的抑制率與降低的不穩(wěn)態(tài)銅的濃度之間的相關(guān)性?？梢钥闯?，Cu2+單獨(dú)暴露組、含有H1的Cu2+暴露組、含有H2的Cu2+暴露組、含有L0的Cu2+暴露組以比生長(zhǎng)率為基礎(chǔ)的抑制率與降低的不穩(wěn)態(tài)銅的濃度之間，雖然正相關(guān)性并不明顯(p>0.1)，但依然呈現(xiàn)正相關(guān)趨勢(shì)。這說(shuō)明導(dǎo)致藻細(xì)胞毒性的主要原因是實(shí)驗(yàn)體系中的不穩(wěn)態(tài)銅。正相關(guān)性不顯著，可能是由于電化學(xué)方法測(cè)定金屬形態(tài)還不能很好地揭示弱結(jié)合的金屬?gòu)?fù)合物，而這部分很有可能是可生物利用的[32]。雖然如此，電化學(xué)方法測(cè)定的不穩(wěn)態(tài)金屬濃度仍是目前作為分析生物可利用的金屬濃度的很好參考。也有藻類生物測(cè)試結(jié)果表明，銅毒性的顯現(xiàn)是由于ASV測(cè)得的不穩(wěn)態(tài)銅[33]。有研究表明，不穩(wěn)態(tài)銅的最高濃度與銅的生物可利用的最高濃度出現(xiàn)在同一個(gè)調(diào)查地點(diǎn)[34]。還有研究表明,大約50%～90%的溶解態(tài)銅是不穩(wěn)態(tài)銅，并且有被生物利用的可能[35]，ASV測(cè)得的不穩(wěn)態(tài)銅與生物可利用的銅具有一致性[35]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，納米Al2O3的加入使得大量銅離子被吸附，進(jìn)而大大降低了藻液中的不穩(wěn)態(tài)銅的濃度，從而降低了Cu2+對(duì)藻細(xì)胞的毒性作用。在本實(shí)驗(yàn)所采用的低濃度下，3種納米Al2O3雖然在親疏水性和分散性之間存在明顯差別，但是對(duì)Cu2+的吸附性能方面不存在顯著差異，造成藻液中的不穩(wěn)態(tài)銅的濃度也不存在明顯差別。因此，含有H1的Cu2+暴露組、含有H2的Cu2+暴露組、含有L0的Cu2+暴露組的藻細(xì)胞毒性沒(méi)有顯著差別。

圖10 不同性質(zhì)的納米Al2O3存在下以比生長(zhǎng)率為基礎(chǔ)的抑制率與降低的不穩(wěn)態(tài)銅的濃度之間的相關(guān)性Fig.10 Correlation between inhibition of growth rate and decreased labile copper concentration

3 結(jié)論

納米Al2O3的存在均可以降低水環(huán)境中Cu2+對(duì)斜生柵藻的毒性效應(yīng)，但其親疏水性質(zhì)對(duì)Cu2+毒性效應(yīng)的影響沒(méi)有顯著的不同。主要表現(xiàn)如下：在納米Al2O3存在下， Cu2+的生物可利用性，Cu2+對(duì)藻細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制和所引起的藻細(xì)胞氧化損傷和藻液中的不穩(wěn)態(tài)銅的濃度都明顯降低。原因主要是納米Al2O3吸附水中的Cu2+，間接降低了藻液中的不穩(wěn)態(tài)銅的濃度，從而減輕了Cu2+對(duì)藻細(xì)胞的毒害。