賈冰冰 葉 夢(mèng) 霍麗蓉

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)在神經(jīng)退行性疾病中流行趨勢(shì)位居第二，表現(xiàn)為肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌強(qiáng)直和靜止性震顫[1，2]。PD的特征在于紋狀體區(qū)黑質(zhì)致密部的多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性壞死和缺失，雖然通過(guò)使用左旋多巴、多巴胺脫羧酶抑制劑、多巴胺激動(dòng)劑和深部腦刺激等方法，臨床癥狀可以得到一定改善，但此類方法未能阻止神經(jīng)元變性死亡[3～5]。PCBP1含有3個(gè)KH同源域。在哺乳動(dòng)物中，PCBP1可通過(guò)KH同源域識(shí)別并結(jié)合含多聚胞嘧啶的DNA和RNA序列。PCBP1在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均可表達(dá)，但主要定位于細(xì)胞核。PCBP1基因可被翻譯為具有多功能、多聚胞嘧啶特性的核酸結(jié)合蛋白。PCBP1通過(guò)與多聚胞嘧啶結(jié)合的特性在基因表達(dá)中起著重要作用，如mRNA穩(wěn)定、RNA剪切、特殊基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控等[6，7]。本研究通過(guò)將pEGFP/N-PCBP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HA細(xì)胞，再加入神經(jīng)毒素6-OHDA后，探討PCBP1基因的過(guò)表達(dá)對(duì)人星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響。

材料與方法

1.材料和試劑：人星形膠質(zhì)細(xì)胞由首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院神經(jīng)外科研究所惠贈(zèng)。各種細(xì)胞培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibicol公司；臺(tái)盼藍(lán)購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。CCK-8試劑盒、卡那霉素、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自上海生物工程有限公司。LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。pEGFP/N-PCBP1重組質(zhì)粒為筆者研究室保存。

2.重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1擴(kuò)增與鑒定：以含PCBP1的重組質(zhì)粒為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)目的基因PCBP1進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物：5′-TTCTAGAATTCATGGATGCCGGTGTGACTGAAAGTG-3′，下游引物:5′-TTCTAGAATTCAACCTACACTGTTCTAG-CTGCACC-3′，目的片段包含PCBP1的起始子及終止子并含有EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。將PCR擴(kuò)增片段用EcoR Ⅰ酶切，進(jìn)一步純化后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；將超低溫冰箱中取出的感受態(tài)細(xì)胞置冰上融化，每100μl感受態(tài)細(xì)胞中加入100pg～10ng待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，輕柔混勻，于冰上靜置30min，將離心管置42℃水浴鍋中孵育60s，取出后立即冰上放置2～3min，取適量菌液涂布至卡那霉素抗性的LB平板中，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。孵育后挑取單個(gè)細(xì)菌菌落，于含抗生素的液體培養(yǎng)基中，放置在37℃水平搖床上進(jìn)行擴(kuò)增12～16h。收集菌液進(jìn)行質(zhì)粒提取，將提取質(zhì)粒以EcoRⅠ酶切，純化后進(jìn)行DNA測(cè)序，明確重組質(zhì)粒的準(zhǔn)確性。

3.HA的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染：人源星形膠質(zhì)細(xì)胞系HA細(xì)胞用含10%FBS,1%青霉素-鏈霉素混合的培養(yǎng)基，置于37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔天更換培養(yǎng)基。細(xì)胞達(dá)到90%融合時(shí)，1%PBS洗滌兩遍，用0.125%的胰酶消化，傳代。轉(zhuǎn)染前1天，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，經(jīng)PBS洗滌和胰酶消化后，按照104個(gè)/毫升濃度接種到6孔板中，在細(xì)胞鋪滿皿底時(shí)，將細(xì)胞上清液棄掉，更換為不含雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)8h后，用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑對(duì)HA細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取3μg的pEGFP/N1-PCBP1或pEGFP/N1質(zhì)粒與250ml的opti-MEM混勻，且將10μl的脂質(zhì)體與250ml的opti-MEM混勻，室溫孵育5min后分別將兩種質(zhì)粒與脂質(zhì)體進(jìn)行混勻，室溫靜置20min,再將混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，邊滴加邊晃動(dòng)培養(yǎng)皿。轉(zhuǎn)染48h后在倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP-N1可發(fā)綠色熒光。

4.CCK-8法檢測(cè)PCBP1對(duì)6-OHDA作用的HA細(xì)胞生長(zhǎng)狀況的影響：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按5×103個(gè)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔100μl培養(yǎng)基。將細(xì)胞分為pEGFP/N1-PCBP1(實(shí)驗(yàn)組)和pEGFP/N1(對(duì)照組)，按照上述方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24h時(shí)分別將5、10、20、30μmol/L的6-OHDA滴加到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，每個(gè)樣本重復(fù)5次。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，每孔加10μl CCK-8溶液，于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱孵育3h后，應(yīng)用酶聯(lián)免疫儀檢測(cè)于波長(zhǎng)450nm處測(cè)定吸光度(A)值。

5.細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞按2×104個(gè)接種到12孔培養(yǎng)板中，每孔1.5ml培養(yǎng)基，分別對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24h時(shí)將5、10、20、30μmol/L的6-OHDA滴加到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中，設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)48h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞密度。同時(shí)，將各組細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后，制備細(xì)胞懸液，經(jīng)臺(tái)盼藍(lán)染色后，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

結(jié) 果

1.重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1的鑒定：重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1經(jīng)酶切，純化后進(jìn)行DNA測(cè)序及瓊脂糖凝膠電泳，PCBP1基因插入位點(diǎn)及所編碼序列正確(圖1)。

圖1 DNA測(cè)序分析重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1箭頭所指為PCBP1基因插入質(zhì)粒的相應(yīng)位點(diǎn)

2.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HA細(xì)胞:用對(duì)照質(zhì)粒 pEGFP/N1和重組pEGFP/N1-PCBP1分別對(duì)HA細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48h后，在倒置熒光顯微鏡下觀察，pEGFP/N1和pEGFP/N1-PCBP1發(fā)出綠色熒光(圖2)。

圖2 倒置熒光顯微鏡分析質(zhì)粒在BV-2細(xì)胞中的表達(dá)(×20)A.對(duì)空載質(zhì)粒pEGFP/N1在HA細(xì)胞中的表達(dá)；B.重組質(zhì)粒pEGFP/N1-PCBP1在HA細(xì)胞中的表達(dá)

3.PCBP1對(duì)6-OHDA作用的HA細(xì)胞生長(zhǎng)變化的影響：將HA細(xì)胞種植于12孔板中，轉(zhuǎn)染后24h，將不同濃度的6-OHDA滴加到實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)3天開始進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞A值。細(xì)胞計(jì)數(shù)法和CCK-8法顯示,5、10μmol/L 6-OHDA作用下，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞較對(duì)照組增殖加速，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。20、30μmol/L 6-OHDA作用下，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的細(xì)胞增殖情況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3、圖4)。

圖3 細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)PCBP1轉(zhuǎn)染后對(duì)HA細(xì)胞增殖的影響與pEGFP/N1組比較，*P<0.05

4.HA細(xì)胞轉(zhuǎn)染PCBP1后的生長(zhǎng)現(xiàn)象:如圖5所示，在5、10μmol/L的6-OHDA作用下，轉(zhuǎn)染PCBP1的HA細(xì)胞明顯達(dá)到80%的匯片率；而20、30μmol/L的6-OHDA作用下，轉(zhuǎn)染PCBP1的HA細(xì)胞與對(duì)照組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀況比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 CCK-8法檢測(cè)PCBP1轉(zhuǎn)染后對(duì)HA細(xì)胞增殖的影響與pEGFP/N1組比較，*P<0.05

圖5 PCBP1轉(zhuǎn)染后促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)現(xiàn)象(×20)A.5μmol/L 6-OHDA；B.10μmol/L 6-OHDA；C.20μmol/L 6-OHDA；D.30μmol/L 6-OHDA。1.對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；2.實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況

討 論

PCBP1在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用逐漸成為目前研究的熱點(diǎn)[8]。PCBP1主要通過(guò)與多聚胞嘧啶的結(jié)合發(fā)揮重要生物學(xué)作用[9]。PCBP1含有兩種核定位信號(hào)序列(nuclear localization signal,NLS)，NLS可調(diào)節(jié)蛋白由細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。PCBP1可作為特殊基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，參與環(huán)境信號(hào)轉(zhuǎn)錄應(yīng)答的調(diào)節(jié)。PCBP1主要參與pre-mRNA的編輯和選擇性剪切、mRNA出核和翻譯調(diào)控等[10,11]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)一種最為嚴(yán)重的核纖層疾病——早老綜合征(Hutchinson-Gilford progeria syndrome，HGPS)，與PCBP1可能密切相關(guān)，此研究證明在早老綜合征細(xì)胞中可見Lamin A聚集在核內(nèi)膜，PCBP1可與Lamin A/C結(jié)合又可作為Progerin的相互作用伙伴。PCBP1用于調(diào)節(jié)早老綜合征細(xì)胞中的各種RNAs和蛋白質(zhì)的表達(dá)仍有待進(jìn)一步研究。由此看來(lái)，PCBP1可能與細(xì)胞的復(fù)制分化過(guò)程有關(guān)，此功能的干預(yù)可關(guān)系到早老綜合征的病理進(jìn)程[12]。小熱休克蛋白(the small heat shock protein,HSPB1)突變可導(dǎo)致嚴(yán)重的周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病[13,14]。Geuens等[15]研究發(fā)現(xiàn)，PCBP1可與HSPB1-P182L突變蛋白特異性結(jié)合，而導(dǎo)致其翻譯抑制活性的降低。通過(guò)RNA免疫沉淀法對(duì)小鼠大腦RNA測(cè)序顯示PCBP1 mRNA為HSPB1-P182L突變蛋白作用靶點(diǎn)，且這些靶點(diǎn)由大量的 3′-和5′-UTRs以及豐富的CTCCTCCTCCTCC共有序列組成。因此，在神經(jīng)退行性疾病中，HSPB1可與PCBP1相互作用降低翻譯抑制性。

本研究將PCBP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察，PCBP1主要在神經(jīng)元細(xì)胞系SH-SY5Y細(xì)胞的胞質(zhì)和核膜中廣泛表達(dá)，且細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯增加[16]。在本研究中，重點(diǎn)關(guān)注PCBP1對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，在神經(jīng)毒素6-OHDA作用下，PCBP1對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況有何影響。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)CCK-8法和細(xì)胞計(jì)數(shù)法證明，與對(duì)照組比較，在低濃度的6-OHDA作用下，轉(zhuǎn)染PCBP1重組基因的HA細(xì)胞生長(zhǎng)明顯加劇。推測(cè)可能是由于6-OHDA進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后激起氧化活性物質(zhì)(ROS)、超氧化物(H2O2)等產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞不可逆性死亡[17]。然而，神經(jīng)細(xì)胞壞死的嚴(yán)重程度與6-OHDA的濃度有明顯關(guān)系[18，19]。本研究初步證明了PCBP1對(duì)神經(jīng)毒素有一定的抗性作用，且在星形膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)育中起重要作用。