汪文俊，王勝軍，余誠，余程，向福

(1武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實驗室，中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074；2 湖北省武昌實驗中學(xué)高二(9)班，武漢 430060 ；3大別山特色資源開發(fā)湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，黃岡師范學(xué)院，黃岡 438000)

近年飼料、食品及其原料廣泛受到霉菌毒素污染是一個全球性問題，黃曲霉毒素尤其是黃曲霉毒素B1(AFB1)的殘留問題尤被關(guān)注[1].AFB1嚴(yán)重危害人畜生命和生產(chǎn)安全，對肝臟有特殊的親和性，經(jīng)肝臟代謝為毒性極強(qiáng)的AFB1-8,9-環(huán)氧化物(AFBO)等，影響動物生長性能、消化代謝、肉品質(zhì)甚至導(dǎo)致死亡[2-4].

酵母細(xì)胞壁上富含的葡甘露聚糖(GM)是由甘露糖和葡萄糖通過β糖苷鍵連接而成的高分子多糖[5]，葡甘露聚糖對霉菌毒素有很強(qiáng)的吸附作用，能有效抵抗霉菌毒素的毒性[6-8].蝦青素(3,3′-二羥基-β,β′-胡蘿卜素-4,4′-二酮，ASTA)是一種重要的類胡蘿卜素，有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等活性，因其優(yōu)良的色素沉積作用并能促進(jìn)動物發(fā)育，在飼料工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)及醫(yī)藥工業(yè)中應(yīng)用廣泛[9]，前期研究表明ASTA對AFB1引起的肉雞肝損傷有顯著改善作用，其與GM配合使用能顯著地消除AFB1的毒害作用[10].

紅法夫酵母富含ASTA和GM，本文從紅法夫酵母中提取GM、ASTA，并將二者制備復(fù)合物，對提取物及其復(fù)合物進(jìn)行了表征，并考察了其對AFB1致肉雞肝損傷的影響.

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

全自動發(fā)酵罐(Biostat 5, B. Braun, Germany，工作體積為3 L)；傅里葉變換紅外光譜儀(EQUINOX55型，德國Bruker)；熱失重分析儀(NETZSCH STA 4493F3，耐馳科學(xué)儀器)；全自動生化分析儀(7020，日本日立).

1.2 菌種與培養(yǎng)條件

紅法夫酵母4 ℃保藏于YM斜面.YM培養(yǎng)基：葡萄糖10 g/L、酵母浸粉3 g/L、蛋白胨5 g/L、麥芽汁3 g/L、瓊脂20 g/L (用于制作平板時添加)，pH 5.0.發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖50 g/L、酵母浸粉8 g/L、KH2PO41.5 g/L、NaH2PO41 g/L、MgSO42 g/L，自來水配制，pH 5.0.斜面上挑取一環(huán)菌種于YM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜后種子液以10%(體積比)接種量接種到500 mL三角瓶(含有YM培養(yǎng)基50 mL)中，18 ℃、200 r/min下?lián)u床振蕩培養(yǎng)36 h制備種子液，將種子液按10%接種量接種到在5 L全自動發(fā)酵罐中于20 ℃、攪拌速度200 r/min、通氣量為0.36 vvm下進(jìn)行培養(yǎng)80 h.

1.3 GM、ASTA提取和復(fù)合物制備

GM和ASTA提取方法參見文獻(xiàn)[11,12].將丙酮溶解的ASTA (100 mg/L)緩慢加入GM丙酮液[δ(ASTA∶GM)=1∶100]，同時劇烈攪拌30 min，室溫?fù)]發(fā)丙酮，得到GM-ASTA復(fù)合物.

1.4 紅外光譜分析

將GM、GM-ASTA復(fù)合物、GM和ASTA物理混合物(兩種物質(zhì)按質(zhì)量比1∶100的比例混合所得)經(jīng)KBr壓片，在紅外光譜儀上4000～400 cm-1區(qū)間紅外掃描.

1.5 熱失重分析

準(zhǔn)確稱取GM、GM-ASTA復(fù)合物、GM和ASTA物理混合物20～25 mg，進(jìn)行熱失重分析，N2氣氛，流速40 mL/min，升溫速度20 ℃/min，溫度范圍20～600 ℃.

1.6 GM-ASTA復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)分析

利用Hyperchem軟件模擬GM空間結(jié)構(gòu)(力場: MM+，幾何優(yōu)化: Polak-Ribiere)，GM和ASTA結(jié)構(gòu)如圖1所示.利用frodock軟件，基于范德華力、靜電力和疏水作用力進(jìn)行計算，預(yù)測GM和ASTA之間相互作用的可能性位點(diǎn)[13].

圖1 ASTA和GM的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 The molecular structure of ASTA and GM

1.7 GM-ASTA復(fù)合物對AFB1致肉仔雞肝損傷的影響

1.7.1 試驗設(shè)計及基礎(chǔ)日糧

1日齡商品代艾維茵肉仔雞，正常飼料育雛10 d后，選取90只隨機(jī)分為3個處理組，每個處理5個重復(fù)，每個重復(fù)6只雞，具體如下：(1)對照組：正常玉米組；(2)AFB1飼料組：含有400 mg/kg AFB1；(3)復(fù)合物組：含有400 mg/kg AFB1+5 g/kgGM-ASTA復(fù)合物.為防止在飼養(yǎng)過程中飼料霉變，配料前所有玉米的含水率控制在12%以下，并于干燥、陰涼條件下存放.基礎(chǔ)日糧配制見文獻(xiàn)[14].

1.7.2 飼養(yǎng)管理

采用網(wǎng)上平養(yǎng)的方式，每籠6只，試驗前將雞舍、雞籠進(jìn)行徹底清掃，熏蒸消毒.于第7、21 日齡接種新城疫IV苗，28日齡接種法式囊疫苗.從第10 d正式開始試驗，飼喂相應(yīng)的飼糧.整個試驗內(nèi)，雞自由采食和飲水.第1周室溫控制在32～36 ℃，以后每周降低2 ℃，直至溫度降至25 ℃，最后控制在22～25 ℃之間，相對濕度約55%～60%，飼養(yǎng)期為42 d.

1.7.3 肉雞肝臟指標(biāo)分析

于35日齡，每個重復(fù)隨機(jī)選取體重相近的2只雞，取肝臟中部約5 g，裝入5 mL凍存管中，立即浸入液氮后置-80 ℃低溫冰箱中保存，采用相關(guān)試劑盒測定丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD).取部分肝組織于10%中性福爾馬林溶液中固定，進(jìn)行組織病理學(xué)觀察.經(jīng)脫水、浸蠟、包埋、切片等處理步驟，再經(jīng)蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察.

2 結(jié)果與分析

2.1 GM-ASTA復(fù)合物紅外光譜

GM、GM-ASTA物理混合物、GM-ASTA復(fù)合物經(jīng)KBr壓片，在4000～400 cm-1區(qū)間進(jìn)行紅外光譜掃描，結(jié)果見圖2.如圖2所示,紅外圖譜中含有多個特征吸收峰[11]，在3420.1 cm-1處有強(qiáng)的O—H鍵的伸縮振動引起的特征吸收，在2936 cm-1和1393 cm-1處有兩組糖類C—H的伸縮振動引起的特征峰，分別代表了糖類C—H伸縮振動與變角振動，1470 cm-1處為GM-ASTA復(fù)合物的—CH鍵因形成復(fù)合物而轉(zhuǎn)向更低的波長，由于二者之間形成了氫鍵，在1641 cm-1處有C—O非對稱伸縮振動峰，1073 cm-1處為O—H變角振動峰，紅外光譜在1700～1775 cm-1范圍內(nèi)無吸收.

圖2 GM-ASTA復(fù)合物紅外光譜Fig.2 Infrared spectrum of GM-ASTA complex

2.2 GM-ASTA復(fù)合物熱失重分析

GM、GM-ASTA物理混合物、GM-ASTA復(fù)合物在N2氛圍下以20 ℃/min速度升溫進(jìn)行熱失重分析，結(jié)果見圖3.如圖3所示：3種樣品為兩階段熱失重過程，第一階段熱失重溫度區(qū)域幾乎相同，在50～150 ℃之間，主要為樣品吸附水分損失而形成的失重；而第二階段的熱失重主要為樣品分解產(chǎn)生的失重，其中GM-ASTA復(fù)合物最穩(wěn)定，熱分解溫度為275 ℃，較GM、GM-ASTA物理混合物的熱失重溫度250 ℃高了約25 ℃，表明在GM和ASTA之間發(fā)生某種作用而形成了GM-ASTA復(fù)合物，提高了其二次熱失重的穩(wěn)定性.此外，GM-ASTA兩階段的熱失重率分別為62.22%和13.81%，表明復(fù)合物形成過程是按一定的比例進(jìn)行的.

圖3 GM-ASTA的熱失重分析Fig.3 Thermo-gravimetric analysis of GM-ASTA

2.3 GM-ASTA復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)擬合分析

GM-ASTA復(fù)合物結(jié)合位點(diǎn)擬合分析計算共發(fā)現(xiàn)248個結(jié)果，其中相關(guān)性最高的結(jié)果見圖4.如圖4所示，ASTA結(jié)合在GM的兩側(cè)鏈間，不與乙?；Y(jié)合(從而不影響溶解性)，而是通過與側(cè)鏈的C24，C25，O29等原子，和主鏈的C12、C13、C14、C20，C21，O14，O17、O18、O20等原子形成較強(qiáng)的范德華力和靜電力而緊密結(jié)合.

a)骨架結(jié)構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)圖; b) 分子結(jié)構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)圖圖4 GM與ASTA結(jié)合位點(diǎn)分析Fig.4 Binding site analysis of GM and ASTA

2.4 GM-ASTA復(fù)合物緩解AFB1致肉仔雞肝損傷

2.4.1 GM-ASTA復(fù)合物對抗氧化水平的影響

肉雞35日齡肝臟組織中SOD，MDA活性結(jié)果見表1.

表1 GM-ASTA復(fù)合物對肉雞肝臟組織中SOD、MDA活性的影響
Tab.1 Effects of the GM-ASTA complex on the activitiy of SOD and MDA from broiler liver tissue

SOD/(U·mg-1)MDA/(nmol·mg-1) 298±19 4.81±0.53 AFB1 245±24? 5.29±0.90? GM-ASTA 286±48 4.47±0.51

*與對照組相比，P<0.05

由表1可見，AFB1污染飼料SOD活性較對照組顯著降低(P<0.05)，MDA活性具有增加的趨勢，但差異不顯著(P>0.05)，表明AFB1污染飼料可降低肝臟的抗氧化能力.與AFB1污染飼料組和對照組相比，GM-ASTA復(fù)合物組SOD和MDA活性差異均不顯著(P>0.05)，表明GM-ASTA吸附劑緩解了發(fā)霉飼料所致抗氧化能力的下降.

不同試驗組肉雞肝臟組織病理學(xué)結(jié)果如圖5所示.由圖5a中對照組肝臟中央靜脈結(jié)構(gòu)清楚，肝細(xì)胞大小一致，胞核、胞漿清晰；圖5b中AFB1組脂肪變性肝細(xì)胞較多，局部紅細(xì)胞略變，部分胞漿內(nèi)有不清晰的小泡，間結(jié)成分少，部分存在淋巴細(xì)胞小結(jié)，局部紅細(xì)胞脂變，間質(zhì)內(nèi)管道系統(tǒng)上皮細(xì)胞增生，增生結(jié)節(jié)更明顯；而圖5c中GM-ASTA組基本結(jié)構(gòu)清晰一致，少量淋巴細(xì)胞小結(jié)淤血，部分肝細(xì)胞輕度變性，有個別輕度脂變，未見明顯異常.說明GM-ASTA具有較好的AFB1解毒能力.

a)對照組; b) AFB1組; (c) GM-ASTA+AFB1組圖5 不同試驗組肉雞肝臟組織病理學(xué)Fig.5 Broiler liver histopathology under different treatments

3 討論

研究表明酵母細(xì)胞壁中GM對霉菌毒素有很強(qiáng)的吸附作用，能有效抵抗霉菌毒素的毒性[7-9]，前期研究表明GM和ASTA共同作用能有效地降低AFB1毒性，緩解AFB1誘導(dǎo)的肉雞肝損傷，效果與對照物污染飼料組無顯著差異，對AFB1有明顯的吸附作用并具有解毒效果[11].多糖分子與小分子之間往往通過靜電引力、范德華力或疏水作用發(fā)生相互作用而形成復(fù)合物[15,16].如能將GM和ASTA制備成復(fù)合物，用于AFB1的吸附解毒，會有良好的效果.為此本文采用紅外光譜、TGA分析及分子對接模擬研究從紅法夫酵母提取的GM、ASTA制備的GM-ASTA復(fù)合物，證明ASTA和GM主鏈通過范德華力和靜電力緊密結(jié)合而形成了復(fù)合物, 復(fù)合物中GM、ASTA結(jié)合較穩(wěn)定.

AFB1中毒的癥狀包括肝組織中出現(xiàn)大的脂肪空泡聚集在核的周圍，對肉雞的肝臟造成中度至重度水腫和肝細(xì)胞脂肪化[9].本實驗中AFB1飼料組導(dǎo)致明顯的脂肪變性、淋巴細(xì)胞增生和血管充血，表明AFB1對肝組織造成了損傷，GM-ASTA復(fù)合物組基本正常，其緩解程度與血液生化指標(biāo)和抗氧化水平結(jié)果相一致，說明GM-ASTA復(fù)合物能顯著的改善AFB1導(dǎo)致的肉雞肝損傷，其具有吸附AFB1并解除其毒性的雙重功效.