于文平，張亞豪，吳正云，宮尾茂雄，張文學(xué),2*

(1.四川大學(xué) 輕紡與食品學(xué)院，成都 610065；2.四川大學(xué)錦江學(xué)院 白酒學(xué)院， 四川 眉山 620860；3.東京家政大學(xué) 家政學(xué)部，日本 東京 173-8602)

泡菜是一種以新鮮蔬菜為原料，在一定濃度食鹽水中泡漬，厭氧或兼性厭氧條件下自然發(fā)酵而成的蔬菜制品[1]。中國泡菜歷史悠久，文化深厚，最早可追溯到3000年前的周朝[2]。四川泡菜口感脆嫩，營養(yǎng)豐富，富含多種維生素、有機(jī)酸和活性乳酸菌，在中國西南地區(qū)被廣泛食用[3]。目前，對于泡菜的研究大多停留在對泡菜原料、發(fā)酵工藝的優(yōu)化及風(fēng)味物質(zhì)的分析，對泡菜中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究較少，如侯方麗等[4]以甘藍(lán)為原料，通過自然發(fā)酵方式，探究出甘藍(lán)泡菜發(fā)酵的最佳工藝，曹東等[5]采用SPME-GC-MS 對自制泡菜在發(fā)酵過程中不同時(shí)期的揮發(fā)性風(fēng)味進(jìn)行分析。

近年來，分子生物學(xué)免培養(yǎng)技術(shù)被廣泛地應(yīng)用到傳統(tǒng)釀造食品的微生物群落研究中，其中，變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)是一種根據(jù)DNA片段溶解性質(zhì)而使之分離的技術(shù)，最先由Muyzer等[6]提出，主要用于檢測樣品中免培養(yǎng)微生物的組成；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)作為一種對微生物進(jìn)行定量的手段而被廣泛用于各種食品的微生物定量分析。為探究四川工業(yè)泡菜發(fā)酵過程中微生物群落結(jié)構(gòu)，本研究利用PCR-DGGE和qPCR技術(shù)對四川工業(yè)青菜泡菜中主要微生物進(jìn)行定性和定量分析，旨在為四川泡菜的工業(yè)化發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：取發(fā)酵1，3,5,13,26,41,68,81,103,110 d的青菜泡菜液(四川李記醬菜調(diào)味品有限公司)，置于-20 ℃下貯藏，以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

試劑：E.Z.N.A.?水樣DNA提取試劑盒(美國Omega公司)、DNA Marker(片段約200～2000 bp)；瓊脂糖；2×Tag PCR MasterMix(法國Biowest公司)；40%丙烯酰胺; 雙丙烯酰胺; 5×TAE緩沖液；尿素；過硫酸銨；去離子甲酰胺、SYBR Green I；無水乙醇；異丙醇；亞鐵氰化鉀；乙酸鋅；四硼酸鈉；對氨基苯磺酸；亞硝酸鈉；鹽酸萘乙二胺；0.1 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2 儀器

pH計(jì)(PHS-3C)、鹽度計(jì)(PAL-SALT)；手持式阿貝折光儀(WZ-201)；梯度PCR儀(MyCyclerTMThermal Cycler)；高速冷凍離心機(jī)(Sorvall Legend Micro 17R)；DGGE(D-CodeTMUniversal Mutation Detection System)；熒光定量PCR儀(LightCycle?Nano)；電泳儀(DYY-5)；凝膠成像儀(Gel DocTMXR+)；核酸微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)；單人單面凈化工作臺(SW-CJ-1FD)；迷你離心機(jī)(LX-400)；數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH)；微型旋渦混合儀(WH-2)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 泡菜理化指標(biāo)測定

pH、鹽度(salinity)、可溶性固形物(TSS)，分別使用pH計(jì)、鹽度計(jì)和手持式阿貝折光儀參照儀器使用方法測定。

泡菜液中總酸(以乳酸計(jì)，TTA)含量采用GB/T 12456-2008《食品中總酸的測定》[7]方法測定。

泡菜液中亞硝酸鹽含量(nitrite concentration)采用GB 5009.33—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定》[8]方法測定。

1.3.2 泡菜DNA提取及PCR擴(kuò)增

利用E.Z.N.A.?水樣DNA提取試劑盒提取泡菜液樣品中微生物的基因組DNA。使用P3f (5′-CC TAC GGG AGG CAG CAG-3′)和P2r (5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)進(jìn)行16S rRNA擴(kuò)增，使用NS3f (5′-GC AAG TCT GGT GCC AGC AGC C- 3′)和YM951r (5′-TTG GCA AAT GCT TTC GC- 3′)進(jìn)行18S rRNA擴(kuò)增[9]。擴(kuò)增體系為50 μL，包括2×PCR Mix(5 mL)，前后引物各20 pmol，DNA模板10 ng，用雙蒸水補(bǔ)足。擴(kuò)增程序參照Liang等[10]的方法擴(kuò)增產(chǎn)物使用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳得到目的條帶。

1.3.3 PCR-DGGE分析

將1.3.2得到的擴(kuò)增產(chǎn)物在8%聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，電泳液是1×TAE緩沖液。細(xì)菌和真菌凝膠電泳的變性劑梯度濃度范圍分別是30%～55%和20%～40%。細(xì)菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在200 V恒壓下電泳4 h，真菌PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在160 V恒壓下電泳4.5 h。電泳結(jié)束后，用Gel DocTMXR (Bio-Rad Laboratories)進(jìn)行成像，觀察結(jié)果。

將圖譜上的主要條帶進(jìn)行切割回收，將回收產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行克隆測序。將測序序列在NCBI中用BLAST進(jìn)行序列對比，獲得與GenBank數(shù)據(jù)庫中相似的序列，然后在RDP中進(jìn)行分類。

1.3.4 qPCR分析

實(shí)時(shí)熒光定量PCR用于檢測青菜泡菜發(fā)酵過程中乳桿菌屬的數(shù)量變化。擴(kuò)增引物為Lac-f(5′-GCA GCA GTA GGG AAT CTT CCA-3′)和Lac-r(5′-GCA TTY CAC CGC TAC ACA TG-3′)[11]。擴(kuò)增反應(yīng)體積是20 μL(1 mL SYBR?Green PCR Master Mix, 2 pmol引物，DNA模板，用雙蒸水補(bǔ)足)。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)末端收集熒光信號。反應(yīng)結(jié)束后，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)作為橫坐標(biāo)，閾值循環(huán)數(shù)Cq作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 泡菜發(fā)酵過程中的理化特性

泡菜發(fā)酵過程中pH、TTA、TSS、鹽度和亞硝酸鹽含量的變化見圖1。

觀察泡菜pH的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵的進(jìn)行，泡菜液的pH從起始的5.90逐漸下降，最終穩(wěn)定在3.88；泡菜的起始TTA含量為0.67 g/L，隨著發(fā)酵進(jìn)行逐漸上升，發(fā)酵81 d后達(dá)到最高6.86 g/L，之后再次下降，至終止取樣時(shí)降至5.53 g/L。一般認(rèn)為，泡菜的pH小于4.0，且TTA大于3.0 g/L，是泡菜成熟的標(biāo)志?？梢姲l(fā)酵81 d時(shí)，青菜泡菜已可認(rèn)為發(fā)酵成熟。

從發(fā)酵開始至發(fā)酵結(jié)束，泡菜TSS和鹽度有所波動(dòng)，但變化不大；前者基本維持在8.80%～11.80%之間，后者基本維持在5.30%～6.60%之間，兩者在發(fā)酵81 d后基本保持穩(wěn)定。

圖1 工業(yè)青菜泡菜發(fā)酵過程中理化特性變化Fig.1 The changes of physico-chemical properties of industrial pickled vegetables during fermentation

亞硝酸鹽具有致癌性，對人體有害，國標(biāo)GB 2762-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》規(guī)定泡菜中的亞硝酸鹽含量限量為20 mg/kg。由圖1可知，泡菜中亞硝酸鹽含量在發(fā)酵第1天為最高峰，亞硝酸鹽主要來源于青菜原料；隨著發(fā)酵進(jìn)行，亞硝酸鹽含量持續(xù)降低，發(fā)酵第3天已低于限量值的一半以下，13 d后保持穩(wěn)定，維持在6.0 mg/kg左右。

2.2 泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)

青菜泡菜發(fā)酵過程中多樣性指數(shù)(H，S和E)大小及其變化見表1。

表1 工業(yè)青菜泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌和真菌多樣性 及乳桿菌屬qPCR定量結(jié)果Table 1 Diversity of bacteria and fungi during industrial pickled vegetables fermentation and qPCR quantitative results of Lactobacillus

H，S和E值分別代表微生物的群落多樣性、豐富度和均勻度。由表1可知，H值從第1天的2.32增至第5天的2.91，但隨后又降至第110天的2.65；S值從第1天的16增加至第13天的24，最終穩(wěn)定在24～26之間；E值在發(fā)酵過程中始終穩(wěn)定在0.82～0.93之間?？偟膩碚f，泡菜發(fā)酵不同階段微生物多樣性、豐富度和均勻度均有變化，推測與泡菜液中pH的變化有關(guān)，不耐酸微生物在低pH環(huán)境下生長受到抑制。

細(xì)菌的DGGE圖譜見圖2中A，共出現(xiàn)30個(gè)條帶，具體測序結(jié)果見表2。

圖2 工業(yè)青菜泡菜的細(xì)菌(A)和真菌(B)PCR-DGGE條帶Fig.2 The bacteria (A) and fungi (B) PCR-DGGE banls of industrial pickled vegetables

注：泳道1～110表示泡菜發(fā)酵的1～110 d，黑色箭頭表示切下測序的條帶，具體測序結(jié)果見表2。

表2 DGGE條帶測序結(jié)果Table 2 The seguencing results of DGGE

續(xù) 表

由圖2中A和表2可知，泡菜樣品含有2個(gè)門，厚壁菌門(Firmicutes，19個(gè)條帶)和變形菌門(Proteobacteria，11個(gè)條帶)，共包含12個(gè)屬，包括乳桿菌屬(Lactobacillus，條帶6，7，8，9，16，18，25，30)、鹽單胞菌屬(Halomonas，條帶17，28，29)、假單胞菌屬(Pseudomonas，條帶4，10，14)，弧菌科細(xì)菌(Vibrionaceaebacterium，條帶2)、環(huán)菌絲屬(Brochothrixthermosphacta，條帶11)、歐文氏菌屬(Erwinia，條帶15)、鹽弧菌屬(Salinivibrio，條帶22)和其他未分類菌屬。

由圖3中A可知，乳桿菌屬是青菜泡菜中主要的優(yōu)勢微生物，這與Liang等[12]之前的研究結(jié)果一致；而Xiong等的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)中國自然發(fā)酵泡菜中主要存在的乳桿菌屬是植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)和玉米乳桿菌(Lactobacilluszeae)。乳酸菌在泡菜發(fā)酵過程中能產(chǎn)生大量的有機(jī)酸，如乳酸、草酸、檸檬酸、醋酸等，導(dǎo)致發(fā)酵液的pH值降低，進(jìn)一步抑制其他雜菌的生長。

圖3 工業(yè)青菜泡菜發(fā)酵過程中細(xì)菌(A) 和真菌(B)屬水平上群落組成Fig.3 Community composition of bacteria (A) and fungi (B) on genera level during industrial pickled vegetables fermentation

由表2可知，工業(yè)青菜泡菜中的乳桿菌屬是消化乳桿菌(Lactobacillusalimentarius)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)。消化乳桿菌能夠抑制腐敗微生物的生長，延長發(fā)酵食品的保質(zhì)期，提高產(chǎn)品的質(zhì)量安全，是天然的生物防腐劑[13]。植物乳桿菌產(chǎn)生的乳酸，是泡菜酸味的主要來源，在發(fā)酵過程中可與醇、醛和酮類發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生大量的風(fēng)味物質(zhì)[14,15]。由圖3中A可知，工業(yè)青菜泡菜中相對含量最高的是乳桿菌屬、鹽單胞菌屬和假單胞菌屬。鹽單胞菌屬能夠耐鹽，分解葡萄糖，產(chǎn)生多種風(fēng)味物質(zhì)，它的存在與工業(yè)生產(chǎn)泡菜“鹽漬”這一步驟有關(guān)[16]。假單胞菌屬存在于新鮮蔬菜中，生存能力強(qiáng)，適應(yīng)環(huán)境范圍廣[17]。

2.3 泡菜發(fā)酵過程中真菌群落結(jié)構(gòu)

真菌DGGE圖譜見圖2中B，共出現(xiàn)了12個(gè)條帶，具體測序鑒定結(jié)果見表2。由表2可知，真菌群落的H值在1.41～1.98之間，S值在5～9之間，E值在0.72～0.92之間，由此可見真菌群落的多樣性和豐富度均低于細(xì)菌群落。結(jié)合圖2中B和表2可知，泡菜樣品含有5個(gè)屬的真菌，分別是德巴利氏酵母屬(Debaryomyces，條帶1,2,5,6,7,8)、假絲酵母屬(Candida，條帶3,11,12)、Cystofilobasidium(條帶10)、酵母屬(Saccharomyces，條帶4)、柯達(dá)酵母屬(Kodamaea，條帶9)，其中德巴利氏酵母屬是工業(yè)青菜泡菜中的優(yōu)勢真菌屬。漢遜德巴利氏酵母屬(Debaryomyceshansenii)是青菜泡菜風(fēng)味物質(zhì)形成的重要菌屬，可以分解葡萄糖產(chǎn)生D-阿拉伯糖和乙酸乙酯，使泡菜風(fēng)味更加協(xié)調(diào)[18]。假絲酵母和酵母屬能夠利用果糖產(chǎn)生酒精[19,20]。

2.4 泡菜發(fā)酵過程中微生物群落的RDA分析

圖4 工業(yè)青菜泡菜微生物群落的RDA分析Fig.4 RDA analysis of microbial community structures of industrial pickled vegetables

注：箭頭和長度表示5種變量與微生物群落結(jié)構(gòu)的相關(guān)性大??；○表示發(fā)酵時(shí)間，△表示微生物名稱。

由圖4可知，亞硝酸鹽含量(nitrite concentration)和鹽度(salinity)與發(fā)酵第1天的相關(guān)性較大，pH與發(fā)酵3～26 d的相關(guān)性較大，TTA和TSS則與發(fā)酵41～110 d的相關(guān)性較大。pH值的變化與發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸有關(guān)，低pH能夠抑制病原菌的生長，從而保證泡菜的安全。pH主要在發(fā)酵前期的作用較為明顯，而TTA在發(fā)酵后期的作用較為明顯，這與圖4反映的信息一致。研究表明，乳桿菌屬能夠抑制發(fā)酵過程中亞硝酸鹽還原酶的活性，降低泡菜中亞硝酸鹽的含量[21]。因此，隨著乳桿菌數(shù)量的增加，泡菜中亞硝酸鹽含量降低，這也解釋了亞硝峰出現(xiàn)在泡菜發(fā)酵前期的現(xiàn)象。

由圖4可知，微生物群落結(jié)構(gòu)與泡菜發(fā)酵進(jìn)程存在一定相關(guān)性，假絲酵母屬(Candida)、Cystofilobasidium、弧菌屬(Vibrio)、鹽厭氧菌屬(Halanaerobium)主要與發(fā)酵前期相關(guān)，假單胞菌屬(Pseudomonas)、Wohlfahrtiimonas、鹽單胞菌屬(Halomonas)、環(huán)絲菌屬(Brochothrix)、海螺菌屬(Marinospirillum)、梭菌屬(Clostridiaceae)、歐文氏菌屬(Erwinia)、德巴利氏酵母屬(Debaryomyces)與發(fā)酵中期相關(guān)，乳桿菌屬(Lactobacillus)、柯達(dá)酵母屬(Kodamaea)、酵母屬(Saccharomycescerevisiae)、鹽弧菌屬(Salinivibrio)、疣微菌科(Ruminococcaceae)與發(fā)酵后期相關(guān)。

2.5 乳桿菌屬的熒光實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果

根據(jù)細(xì)菌DGGE條帶結(jié)果發(fā)現(xiàn)乳桿菌屬是工業(yè)青菜泡菜中的優(yōu)勢菌屬。工業(yè)青菜泡菜發(fā)酵過程中乳桿菌屬數(shù)量的變化見表1，所有樣品中，乳桿菌屬的拷貝數(shù)為107～1011copies/mL，這表明發(fā)酵前后，乳桿菌屬數(shù)量迅速增加，然后下降，最后穩(wěn)定在1011copies/mL，該結(jié)果與張亞豪等[22]的研究結(jié)果一致。

3 結(jié)論

本文結(jié)合PCR-DGGE和qPCR技術(shù)主要研究了工業(yè)青菜泡菜發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)演替規(guī)律及乳桿菌屬含量變化。細(xì)菌群落中，發(fā)現(xiàn)2個(gè)門(厚壁菌門和變形菌門)、12個(gè)屬，主要包括乳桿菌屬、鹽單胞菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬、鹽弧菌屬、歐文氏菌屬等，其中乳桿菌屬是優(yōu)勢菌屬，發(fā)酵過程中其含量維持在107～1011copies/mL。種水平上，優(yōu)勢菌是消化乳桿菌和植物乳桿菌。真菌群落中共檢測到5個(gè)屬，包括德巴利氏酵母菌屬、假絲酵母屬、酵母屬、柯達(dá)酵母屬、Cystofilobasidium，其中德巴利氏酵母屬是優(yōu)勢真菌屬。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，微生物群落結(jié)構(gòu)與發(fā)酵進(jìn)程具有相關(guān)性，因此不同發(fā)酵階段優(yōu)勢菌屬不同。

利用PCR-DGGE和qPCR技術(shù)能夠分析出工業(yè)青菜泡菜發(fā)酵過程中的微生物群落結(jié)構(gòu)，本次研究結(jié)果能夠?yàn)樘岣吖I(yè)化泡菜的質(zhì)量和規(guī)模提供技術(shù)支持。