伍夢婷,郭娟娟,+,許 雄,徐云強,汪 蘭,吳文錦,熊光權(quán),孫衛(wèi)青,*

(1.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北荊州 434023;2.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064)

隨著生活水平的提高,消費者對飲食健康的要求也越來越高。肉制品是多數(shù)消費者飲食結(jié)構(gòu)中必不可少的一部分,低脂低熱量肉制品目前備受關(guān)注。但由于脂肪減少后會喪失肉品原有的質(zhì)地和口感,大大降低消費者對肉制品的接受性,故需要通過合適的替代物來保證產(chǎn)品質(zhì)量的同時降低脂肪含量[1]。

合適的脂肪替代物應(yīng)具有用量少、穩(wěn)定性好、熱量低、無毒副作用和兼?zhèn)洳糠譅I養(yǎng)強化劑的功能等特點[2]。目前,變性淀粉在開發(fā)低脂肉制品中占有重要位置,因為其可以改善產(chǎn)品的感官,保證產(chǎn)品質(zhì)量并且降低生產(chǎn)成本,獲得更好的經(jīng)濟效益[3-4]。近年來,栗俊廣等[5]和吳滿剛等[6]對木薯淀粉在肌原纖維蛋白(MP)凝膠中的功能特性方面做了一些研究,發(fā)現(xiàn)木薯淀粉的添加可以顯著改善肌原纖維蛋白熱誘導(dǎo)凝膠的質(zhì)構(gòu)性。然而,天然淀粉也有許多缺點,例如,水溶性差、穩(wěn)定性不好等。而變性淀粉能夠彌補天然淀粉的不足,從而滿足市場需求[7]。例如,暢陽[8]研究發(fā)現(xiàn)木薯變性淀粉相比原淀粉具有耐高溫、耐酸性、耐高剪切力及穩(wěn)定性等性能。李丹辰等[9]也發(fā)現(xiàn)添加木薯變性淀粉魚糜凝膠強度高于木薯淀粉。目前,研究比較多的是天然淀粉對豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性影響[5-6],或者是木薯變性淀粉對鴨肉、魚肉等蛋白凝膠的影響[7,9],而木薯變性淀粉對豬肉肌原纖維蛋白凝膠特性的作用機理研究相對較少。

為此,本研究以豬肉肌原纖維蛋白為研究對象,分別添加不同濃度的乙?；姿峄臼碜冃缘矸?研究變性淀粉對肌原纖維蛋白凝膠、流變特性以及熱力學(xué)特性的作用規(guī)律,旨在為變性淀粉改善凝膠類肉制品品質(zhì)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豬肉里脊肉 長白豬,6個月,購自湖北省荊州市中百倉儲;木薯變性淀粉(乙?；姿峄臼黼p淀粉) 天和生物科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鎂、乙二醇雙(2-氨基乙基醚)四乙酸(EGTA)、疊氮化鈉(NaN3)、牛血清白蛋白(BSA)等 均為分析純,購自于國藥集團藥業(yè)股份有限公司。

PL303型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司;FSH型高速電動勻漿器 江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠;高速冷凍離心機 美國貝克曼庫爾特有限公司;H-H-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市杰瑞爾電器有限公司;PHS-3C數(shù)字PH計 天津市盛邦科學(xué)儀器技術(shù)公司;TU-1900雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;DSC差示掃描量熱儀 費爾伯恩實業(yè)發(fā)展(上海)有限公司;TMS-PRO質(zhì)構(gòu)儀 美國FTC公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 肌原纖維蛋白的提取 豬肉里脊肉中肌原纖維蛋白的提取參考Doerscher等[10]的方法并略微調(diào)整,取鮮嫩豬里脊肉500 g,去除脂肪和結(jié)締組織,切成小的方塊,放入絞肉機中,絞碎達到均一后稱重。然后將100 g肉放入1000 mL的大燒杯中,加入4倍體積的磷酸緩沖液(0.1 mol/L NaCl,10 mmol/L KH2PO4/K2HPO4,2 mmol/L MgCl2,1 mmol/L EGTA,pH=7.0)用勻漿機于冰水浴中勻漿,時間不宜太長。用兩層紗布過濾到1000 mL的大燒杯中,取過濾液在4 ℃,2500×g離心15 min,取沉淀再分散在4倍體積pH6.0磷酸鹽緩沖溶液(20 mmol/L,KH2PO4/K2HPO4);再在4 ℃,2500×g離心15 min,并收集離心管底部沉淀,重復(fù)此操作兩次。最后在所得沉淀中加入4倍體積0.1 mol/L NaCl溶液,在離心機(4 ℃,2500×g)中離心15 min,得到的沉淀即為粗肌原纖維蛋白,蛋白質(zhì)濃度用雙縮脲法測定[11],使用牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)作為標準蛋白,提取的肌原纖維蛋白放置在4 ℃冰箱里并在24 h內(nèi)用完。

1.2.2 肌原纖維蛋白凝膠的制備 參考暢陽[8]方法并加以改進,用一定量的磷酸鹽緩沖溶液(0.6 mol/L NaCl,50 mmol/L K2HPO4/KH2PO4,pH6.0)使肌原纖維蛋白稀釋至40 mg/mL,再加入MP含量的0%、5%、10%、15%、20%的木薯變性淀粉,利用渦旋機將其充分混合均勻,取5 mL蛋白溶液于10 mL的離心管中,然后將其放置于恒溫的水浴鍋中,使溫度從20 ℃線性升溫到72 ℃(2 ℃/min),并在72 ℃水浴鍋中保溫20 min,之后將其放置于冰水中,使其能夠快速的冷卻,待恢復(fù)室溫后將其置于0～4 ℃的冰箱中24 h,待用。

1.2.3 凝膠質(zhì)構(gòu)測定 參考任云霞等[7]的方法,對肌原纖維蛋白凝膠的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)強度、硬度值、膠黏性、彈性、咀嚼性、內(nèi)聚性進行測定。將冰箱內(nèi)4 ℃冷藏的凝膠樣品拿出并放于室溫下靜置1 h,然后待其溫度降為室溫后,將樣品統(tǒng)一切為直徑為30 mm,高度為20 mm的圓柱體,將切好的樣品放置在質(zhì)構(gòu)儀載體平臺上,結(jié)構(gòu)參數(shù)設(shè)定為:探頭的選擇是P/36R,預(yù)試驗、測中、測后速度都是1.0 mm/s,樣品變形程度為60%,二次壓縮中都要停頓5 s,每次試驗重復(fù)3次。

1.2.4 凝膠的DSC分析 參考李爽等[12]的方法,通過電子分析天平稱取25 mg的蛋白樣品,將稱取好的樣品放置于鋁坩堝中,并要求在密封以及氮氣條件下,將坩堝置于差示掃描量熱儀(DSC)中,以10 ℃/min的升溫速率,從室溫開始,直到溫度上升至180 ℃,氮氣流速設(shè)定為40 mL/min,從而得到肌原纖維蛋白凝膠的DSC譜圖。

1.2.5 凝膠的靜態(tài)流變特性分析 參考Guo等[13]的方法,使用具有0.105 mm間隙的錐形傳感器(C50-1,直徑為35 mm,角度2 °)和測量板蓋(MPC35;222-1549)測量剪切應(yīng)力/剪切速率旋轉(zhuǎn)斜坡測試。將樣品放置在流變儀板上并在25 ℃平衡10 min。 在1～500 s-1的剪切速率下測量MP凝膠的流變特性,一式三份。剪切速率由0.1 s-1增大到 500 s-1(曲線上行部分),再由500 s-1降低到0.1 s-1(曲線下行部分),測定剪切速率變化過程中,凝膠剪切應(yīng)力和表觀黏度的變化。其中,上行和下行曲線結(jié)合可以判斷淀粉糊的觸變性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個實驗重復(fù)三次。 使用Statistix軟件9.0和單向方差分析(ANOVA)進行結(jié)果的統(tǒng)計分析。 采用Fisher’s LSD方法進行均數(shù)間的顯著性差異分析(p<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)標準曲線

以牛血清白蛋白做標準蛋白,采用紫外分光光度法進行測定。其中以測定吸光值為縱坐標,牛血清白蛋白濃度作為橫坐標進行標準曲線的測定,測定標準曲線時波長為 540 nm。肌原纖維蛋白濃度測定的標準曲線的公式為 y=0.5262x+0.0053,R2=0.9995。

圖1 蛋白質(zhì)的標準曲線圖

2.2 變性淀粉對肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

不同比例的木薯變性淀粉對肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響結(jié)果如圖2所示。硬度值可表征凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的強度,即凝膠可以抵抗外力的強弱。隨著添加量的增加,凝膠硬度、強度值、咀嚼性顯著下降,均低于空白組,原因可能是當體系加熱溫度為70 ℃時,淀粉顆粒未能充分吸水膨脹,不能起到對凝膠基質(zhì)施加壓力的作用,導(dǎo)致形成弱凝膠,從而使其強度、硬度值下降。

圖2 木薯變性淀粉的添加對肌原纖維蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)特性的影響

凝膠彈性表示其受到外力壓縮,撤去外力后凝膠的回彈能力。如圖2,隨著添加量的增加,彈性值呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢,整體上處理組均大于空白組。這可能是因為淀粉糊化能形成富有彈性的膠體,從而增加蛋白凝膠的彈性,但隨著添加量的增加,體系游離水分減少,凝膠呈現(xiàn)過硬過韌的現(xiàn)象,從而導(dǎo)致彈性下降[14]。因此,添加適量的淀粉(10%)可對凝膠彈性的提升起到正面作用。而當?shù)矸厶砑舆^量時,過多淀粉的存在則可能會阻礙蛋白自身凝膠的形成,從而降低體系的凝膠彈性。Seetapan 等[15]研究表明木薯淀粉在凝膠中顆?？山龅某煞州^多,這些成分可在凝膠中充當黏合劑的作用,提高凝膠的彈性,并使其在受到壓縮時不會提前破裂,從而改善凝膠的質(zhì)構(gòu)。

膠黏性是指將半固體樣品破裂成吞咽時的穩(wěn)定狀態(tài)所需的能量,除了反映凝膠網(wǎng)絡(luò)的強度外也可反映凝膠的內(nèi)部結(jié)合程度,而內(nèi)聚性則表示凝膠內(nèi)部的結(jié)合能力。添加20%淀粉可明顯提高凝膠的內(nèi)聚性,降低其膠黏性,但并不是線性的。從總體上看,添加量為10%時凝膠的硬度、強度、咀嚼性、膠黏性、內(nèi)聚性相對其他組而言比較適中,且其彈性最好,從而改善其質(zhì)構(gòu)特性。

2.3 變性淀粉對肌原纖維蛋白凝膠DSC的影響

變性淀粉對肌原纖維蛋白凝膠DSC的影響結(jié)果見圖3和表1。

圖3 木薯變性淀粉對肌原纖維蛋白差示熱量掃描的效應(yīng)

由圖3和表1看出,起始熱相變溫度大小順序為:10%<15%<20%<0<5%,添加量為5%時,變性溫度增大,可能是因為添加少量變性淀粉時,其溶解的較快,能較充分的填充到空隙中,增大了凝膠形成的溫度。而隨著變性淀粉添加量近一步增加導(dǎo)致蛋白濃度的減小,變性溫度提前,尤其是10%時最低,可能是因為變性淀粉部分填充到凝膠網(wǎng)絡(luò)中去,剩下的淀粉顆粒促進了蛋白的變性的結(jié)果。李爽[12]也發(fā)現(xiàn)馬鈴薯淀粉的添加降低了蛋白的變性溫度,與本文研究結(jié)果相似。

表1 木薯變性淀粉對肌原纖維蛋白的 起始熱相變溫度(Teo)及焓值(H)的影響Table 1 Effect of cassava modified starch on the initial thermal transition temperatures(Teo) and enthalpies(H)of myofibrillar protein

從整體上焓值隨著變性淀粉的添加而增加,且焓值越大,其熱改性產(chǎn)物聚集卷曲程度越大,熱穩(wěn)定性越好,結(jié)果說明變性淀粉的添加增加了蛋白的穩(wěn)定性,而在10%時,焓值最小,且低于空白組,進一步說明其促進蛋白變性。Wolz等[16]的研究中提到高濃度的蛋白分子間碰撞機會增大，促進蛋白聚集使蛋白變性速度加快,而本實驗中隨著蛋白濃度的減小(淀粉濃度增加)變性溫度卻提前,這可能是變性淀粉的添加促進蛋白的變性。Feng等[17]也得到與本文相似的結(jié)果。

2.4 變性淀粉對肌原纖維蛋白凝膠靜態(tài)流變性的影響

2.4.1 表觀粘度 MP凝膠在添加不同的變性淀粉下的表觀粘度曲線如圖4所示。純蛋白和添加變性淀粉的表觀粘度顯然不是恒定的,當剪切應(yīng)力增加時,表觀粘度下降。這意味著,隨著剪切速率的增加,凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)被破壞或重組,導(dǎo)致表觀粘度降低,這可以通過結(jié)構(gòu)分解來解釋。 剪切力足以破壞將顆粒保持在一起的次級鍵,即使在非常低的剪切速率下也會導(dǎo)致變形,斷裂簇或聚集,這最終導(dǎo)致表觀粘度急劇降低[18]。此外,當剪切速率增加到特定值時,表觀粘度趨于恒定值。因此,純的和添加變性淀粉的蛋白凝膠是假塑性流體。對于假塑性流體,Liu等[19]提出分子糾纏和剪切粘度對剪切速率斜率的下降導(dǎo)致聚合物溶液的剪切稀化行為。另外,添加淀粉并未改變凝膠的流體類型。

圖4 木薯變性淀粉的添加對肌原纖維蛋白凝膠表觀粘度的影響

添加量為5%時,凝膠的表觀粘度明顯增大,表明抗剪切能力和剪切稀化程度也增強。這是由于添加少量變性淀粉時,其溶解的較快,能較充分的填充到空隙中,增大了其對于凝膠沿流動方向運動的阻礙。但當添加量增加到10%時,只有部分填充到凝膠網(wǎng)絡(luò)中去,剩下的淀粉顆粒不足以對凝膠沿流動方向運動造成阻礙,從而使其表觀粘度減小。另外,與10%添加量相比,添加量15%和20%的凝膠表觀粘度增加,但低于空白組?？赡苁且驗橹挥胁糠值矸厶畛涞侥z網(wǎng)絡(luò)中去,過多顆粒的聚集增大了其對凝膠沿流動方向運動的阻礙,從而導(dǎo)致表觀粘度增加。Pang等[20]分析發(fā)現(xiàn)表觀粘度越低,其凝膠的塑性能力越好。李爽[12]認為淀粉含量越高蛋白受淀粉顆粒的影響越大,蛋白分子鏈相對較短,在較小的剪切速率蛋白分子就可以得到有效的伸展。而李艷芳[21]發(fā)現(xiàn)經(jīng)過乙?；鸟R鈴薯淀粉在糊化后有更高的表觀黏度及抗剪切能力,本實驗結(jié)果有所不同,可能是添加淀粉品種不同,從而導(dǎo)致結(jié)果不同。

2.4.2 觸變環(huán)面積 從圖5中看到,在剪切應(yīng)力與剪切速率之間的流動曲線中可以看到滯后環(huán)。這是因為逐漸增強的剪切應(yīng)力使凝膠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)逐漸被破壞,當剪切應(yīng)力減小時,凝膠的結(jié)構(gòu)開始逐漸恢復(fù),但其恢復(fù)的速度與其被破壞的速度有所差異造成滯后環(huán)的出現(xiàn)[21]。另外,滯后環(huán)是順時針的,也就是說在剪切速率增加過程(正向)中剪切應(yīng)力大于減小過程(向后)中的剪切應(yīng)力[19]。根據(jù)Liang等[22]的研究,順時針方向的滯后回路被認為是剪切或形成新結(jié)構(gòu)的原因?qū)е卤旧斫Y(jié)構(gòu)遭到破壞。滯后環(huán)面積可以表征樣品觸變性的強弱,滯后環(huán)面積越大,流體的觸變性越強,滯后環(huán)面積越小,流體的觸變性越弱[21,23]。

圖5 變性淀粉的添加對肌原纖維蛋白凝膠觸變性的影響

從圖5中看到添加量為5%時觸變環(huán)面積增加,原因可能是70 ℃時,淀粉顆粒開始發(fā)生變性致使肌原纖維蛋白凝膠網(wǎng)絡(luò)開始松動,從而使其三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)和淀粉顆粒的鏈接出現(xiàn)空隙,當添加少量變性淀粉時,其溶解的較快,能較充分的填充到空隙中,導(dǎo)致分子間距離變的更近,形成更多的氫鍵,使剪切作用破壞其結(jié)構(gòu)變得困難,凝膠結(jié)構(gòu)恢復(fù)速度也更慢,所以導(dǎo)致滯后環(huán)面積增大;但當添加量增加到10%時,只有部分填充到凝膠網(wǎng)絡(luò)中去,剩下的少許淀粉顆粒不足以破壞其結(jié)構(gòu),從而使其觸變環(huán)面積最小。隨著添加量的進一步增加,觸變環(huán)面積增大?？赡茉蚴亲冃缘矸厶砑恿吭龃髸r,有過多顆粒的聚集阻礙了剪切作用破壞其結(jié)構(gòu),凝膠結(jié)構(gòu)恢復(fù)也比較慢,故使其滯后環(huán)面積增加[21]。流體的觸變性越大,表示撤掉外力時,體系恢復(fù)到原來狀態(tài)的時間更長,流體流動過程中需要克服的阻力也越大,故觸變性越大,流體的剪切穩(wěn)定性越差[24]。故結(jié)果表明當添加量為10%時,其觸變環(huán)面積最小,流變穩(wěn)定性最好。

3 結(jié)論

添加木薯變性淀粉能夠改善肌原纖維蛋白凝膠的彈性和內(nèi)聚性,降低了凝膠的強度,咀嚼性和膠黏性。當木薯變性淀粉添加量為 10%時,凝膠的彈性達到最大。與空白組相比,木薯變性淀粉的添加整體上降低了蛋白的熱相變溫度和增加了蛋白焓值,導(dǎo)致蛋白熱穩(wěn)定性增加;在添加變性淀粉10%的條件下,熱相變溫度和焓值均最低,表明其促進了蛋白變性。凝膠的表觀粘度隨著剪切應(yīng)力增加呈下降的趨勢,表明其是假塑性流體,且添加變性淀粉并未改變其流體類型,靜態(tài)流變分析表明添加10%木薯變性淀粉,肌原纖維蛋白凝膠的表觀粘度和觸變環(huán)面積最小,改善了凝膠的塑性能力及流變穩(wěn)定性。