張 慶,袁 源,鄧揚(yáng)龍,周翔宇,李玉鋒

(西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院,四川成都 610039)

銀耳(TremellafuciformisBerk)又被叫作銀耳子、白木耳、雪耳等,屬真菌類銀耳科銀耳屬,是門擔(dān)子菌門真菌銀耳的子實(shí)體,有“菌中之冠”的美稱[1]。銀耳的栽培方式主要有段木栽培和代料栽培[2],前者以四川通江銀耳聞名,后者則多以福建古田銀耳居多。段木栽培即選用較適宜銀耳生長的樹木,剔去多余枝丫,鋸成約1米左右的木段,晾曬半月后進(jìn)行鉆孔,再點(diǎn)入菌種,讓銀耳自然生長,一年采收一次[3]。而代料栽培則是在有效控制室內(nèi)溫度、濕度的條件下充分利用經(jīng)切碎磨粉后的樹枝,木段或殘余木料等農(nóng)副產(chǎn)品為原料,麥皮、米糠、石膏等為輔助原料,進(jìn)行袋裝或瓶裝栽培[4]。此法節(jié)省大量木材,原料來源充足,栽培周期短,既有利于提高農(nóng)產(chǎn)品的利用價(jià)值,又有利于擴(kuò)大銀耳栽培的范圍,不受有無林區(qū)條件的限制。

據(jù)國內(nèi)外的藥理作用研究,銀耳多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞生長及改善記憶力等多方面活性[5]。目前,國內(nèi)外大多數(shù)學(xué)者對銀耳的研究主要集中在銀耳多糖的生理活性等方面。由于段木銀耳和代料銀耳栽培方式、生長環(huán)境不同,所以其外觀、營養(yǎng)指標(biāo)、生物活性可能會(huì)存在一定的差異。現(xiàn)如今對于這方面的研究與報(bào)道甚少,對不同栽培方式下銀耳多糖物質(zhì)含量、生物活性功能等方面尚未進(jìn)一步認(rèn)識(shí)。

針對上述研究不足,本試驗(yàn)通過堿式提取代料和段木兩種栽培方式銀耳的多糖,測定多糖生物活性、理化性質(zhì),比較兩種栽培方式銀耳理化性質(zhì)的差別,并針對其內(nèi)在特征差異進(jìn)行分析,以期為今后銀耳多糖進(jìn)一步深入研究奠定基礎(chǔ),并對銀耳資源有效利用、產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和生產(chǎn)加工提供一定的參考價(jià)值和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

段木銀耳干樣 四川通江古林銀耳有限公司,含水率為11.7%;代料銀耳干樣 四川天科生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司,含水率為15.2%;氫氧化鈉、石油醚、無水乙醇、95%乙醇、氯仿、正丁醇、乙酸酐、吡啶、乙酸酐、無水葡萄糖、鄰苯二甲酸氫鉀、EDTA 以上均為分析純,成都市科龍化工試劑廠;間羥基聯(lián)苯 上海阿拉丁生化科技股份有限公司,生化試劑;考馬斯亮藍(lán) 南京建成生物工程研究所;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)(含量99%以上) 梯希愛上?；晒I(yè)發(fā)展有限公司(TCI);L-巖藻糖(Fucose,Fuc) 詩丹德生物制藥有限公司;D-葡萄糖(Glucose,Glc)、D-半乳糖(Galactose,Gal)、D-木糖(Xylose,Xyl)、L-鼠李糖(L-rhamnose monohydrate,Rha)、D-葡萄糖醛酸(Glucuronic acid,GlcA)、D-甘露糖(Mannose,Man) 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

TB-214電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;HH-600型數(shù)顯三用水箱 金壇富華儀器有限公司;RE-52AA酸度計(jì)、RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;FDU-1100真空冷凍干燥機(jī) 東京理化器械株式會(huì)社.;PHS-3C型紫外分光光度計(jì) 方舟科技有限公司;SFG-02.400電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司;D2F-6021真空干燥箱 上海一恒科技有限公司;7820A氣相色譜儀 安捷倫;Heto3410超低溫冰箱 上海百蕾真生物科技有限公司;TDZ5-WSTDZ5-WS離心機(jī) 湖南長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 多糖提取與初步純化 干銀耳粉碎過80目篩→堿液提取→提取蒸發(fā)濃縮→脫蛋白→醇沉→凍干→透析→凍干→銀耳精多糖

1.2.1.1 粗多糖的提取 采用堿式提取法提取粗多糖。將段木銀耳與代料銀耳干樣分別粉碎過80目篩后各取1 g,加入0.7 mol/L NaOH溶液,混勻,80 ℃水浴2 h。四層紗布過濾,保留濾液。重復(fù)上述步驟三次,三次提取料液比分別為1∶150、1∶100、1∶100 g/mL。將堿提液用0.1 mol/L鹽酸中和至pH=7.0,中和后的溶液蒸發(fā)(55 ℃,真空度0.09 MPa)至約100 mL[6-7]。

1.2.1.2 多糖的分離純化 sevage法脫蛋白:按吳振亞[8]的方法,稍作改動(dòng)。振蕩時(shí)間為4 h,重復(fù)除蛋白操作6次。可用考馬斯亮藍(lán)G-250檢測,當(dāng)樣品反應(yīng)液與空白對照(樣品替換為等體積蒸餾水，其他完全相同)顏色相同時(shí),即為蛋白質(zhì)除盡。

醇沉與透析:按一定比例(樣液∶乙醇=1∶4,V/V)加入乙醇,于4 ℃低溫中冷藏24 h。取出后,回收乙醇,將絮狀物挑出,置于容器中。所得絮狀物放入超低溫冰箱(-60 ℃)中預(yù)凍約6 h,迅速取出預(yù)凍后的樣品,凍干4～5 h備用。將透析袋在50%的乙醇中煮沸1 h,用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氫鈉和1 mol/L EDTA(pH=8)溶液洗滌,最后用蒸餾水沖洗備用。將凍干銀耳多糖配成10 mg/L溶液裝入透析袋中,留1/2的體積,兩頭用透析夾加緊,放在去離子水中透析。每隔1 h換一次去離子水,然后減慢更換頻率。24 h后取出再凍干,得段木銀耳多糖與代料銀耳多糖的初純物,待測。

1.2.2 蛋白質(zhì)殘留量的測定 取六支試管編號(hào),按順序加入0、20、40、60、80、100 μL 1.0×103μg/L標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(牛血清蛋白),再加入100、80、60、40、20、0 μL的0.9%生理鹽水。各加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.0 mL,充分接觸,孵育5 min,測定A595值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo),A595值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

各吸取銀耳多糖初純物三份,配制為濃度10 mg/mL,加入考馬斯亮藍(lán)G-250試劑3.0 mL,充分混勻,孵育5 min后,測定A595值。根據(jù)A595值,在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出樣品中蛋白質(zhì)含量。以水作為空白對照。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo),吸光值為縱坐標(biāo),得到蛋白含量曲線。

1.2.3 多糖含量的測定 采用苯酚-硫酸法測定銀耳提取液中多糖含量[9]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制:采用60 ℃烘干至恒重的無水葡萄糖為標(biāo)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線;將樣品稀釋至3～10倍,用分光光度法測定其吸光值,結(jié)合以下公式得多糖含量。

多糖含量(mg/mL)=葡萄糖含量×稀釋倍數(shù)×0.9×100(0.9為校正系數(shù))

運(yùn)用曾麗萍等[10]的方法測定多糖的得率。

多糖得率(%)=多糖含量×稀釋倍數(shù)/樣品干重×100

1.2.4 多糖硫酸根、糖醛酸含量的測定 運(yùn)用吳瓊等[11]的方法,采用硫酸鋇-比濁法測定多糖中硫酸根含量,稱取干燥至恒重的K2SO4測定繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線,多糖樣品溶液為5 mg/mL。

運(yùn)用姜瑞芝等[12]的方法,采用間羥基聯(lián)苯法測定多糖中糖醛酸含量,稱取60 ℃干燥至恒重的無水葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品測定繪制得標(biāo)準(zhǔn)曲線,多糖樣品溶液為5 mg/mL。

1.2.5 多糖的單糖組成測定與分析 樣品預(yù)處理[13]:準(zhǔn)確稱取5 mg多糖樣品于試管中,加入2 mL 2 mol/L的硫酸將其溶解,于110 ℃條件下水解8 h,滴入2 mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至中性,再加入4%的硼氫化鈉,室溫反應(yīng)1.5 h,緩慢加入冰醋酸直至無氣泡產(chǎn)生。再復(fù)濃縮,直至將酸除盡。將稀釋的樣品真空冷凍干燥24 h,加吡啶及正丙胺各1 mL,混勻,于55 ℃下水浴30 min,真空冷凍干燥24 h,再加入吡啶及乙酸酐各0.5 mL,混勻,于95 ℃條件下水浴1 h,氮?dú)獯蹈?經(jīng)真空冷凍干燥24 h后以氯仿溶解,進(jìn)行GC分析。

單糖標(biāo)準(zhǔn)品處理:稱取葡萄糖、巖藻糖、甘露糖、木糖、半乳糖、鼠李糖和葡萄糖酸各10 mg,混合,與上述步驟一致。以單糖乙?；a(chǎn)物峰面積為縱坐標(biāo),濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

氣相色譜法(GC)條件:進(jìn)樣口溫度248 ℃,檢測器溫度281 ℃,載氣為99.99%高純氮?dú)?控制氣體流速為0.6 mL/min;分流進(jìn)樣,分流比為20∶1,進(jìn)樣量5 μL;升溫程序:200 ℃保持2 min,以3 ℃/min的速率升至245 ℃,再以10 ℃/min的速率升至275 ℃,保持2 min[15]。

1.2.6 多糖的抗氧化活性測定

1.2.6.1 銀耳多糖DPPH自由基清除能力測定 運(yùn)用劉培勛等[16]、Deng等[17]的方法進(jìn)行銀耳多糖DPPH自由基清除能力的測定。取銀耳多糖樣品配制為5 mg/mL,置于10 mL離心管中,加入無水乙醇稀釋的0.004%的DPPH溶液3.0 mL,室溫避光反應(yīng)30 min,平行以無水乙醇為空白對照,3000 r/min離心10 min,取上清液,于517 nm波長處測定吸光值并記錄,將樣品放置0.5、1.0、1.5、2.0 h然后每隔2 h測定一次直到18 h后在517 nm測定吸光值,記錄數(shù)據(jù),以5 mg/mL VC為陽性對照。根據(jù)吸光值大小,得出DPPH自由基清除率隨時(shí)間變化的規(guī)律。

DPPH自由基清除率(%)=[A0-(As-Ac)/A0]×100

式中,A0:1.0 mL蒸餾水+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值;As:1.0 mL樣品溶液+3.0 mL DPPH溶液的吸光度值;Ac:1.0 mL樣品溶液+3.0 mL無水乙醇的吸光度值。

1.2.6.2 銀耳多糖羥自由基清除能力測定 參考運(yùn)用張澤生等[18]、陳英紅等[19]、顏軍等[20]的方法進(jìn)行羥自由基清除能力測定;取提取液1 mL,依次加入5 mmol/L鄰二氮菲溶液1 mL,0.2 mol/L PBS(pH=7.4)2 mL,5 mmol/L FeSO4溶液和0.1% H2O2各1 mL,于37 ℃反應(yīng)60 min,4000 r/min離心10 min,于536 nm處測定吸光值。銀耳提取液清除羥自由基的能力與同濃度VC的比較,結(jié)果用VC等價(jià)抗氧化能力VEAC(VCequivalent antioxidant capacity)表示。

羥自由基清除率(%)=(Ao-Ax+Axo)/Ao×100

式中:Ao-空白對照組的吸光度;Ax-待測液的吸光度;Axo-不加入顯色劑H2O2的待測液的本底吸收值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)操作3次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同栽培方式銀耳多糖各項(xiàng)營養(yǎng)指標(biāo)分析

2.1.1 不同栽培方式銀耳多糖中蛋白質(zhì)殘留量 圖1為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖1得到回歸方程為y=0.008x+0.0348(R2=0.9918),由所測試驗(yàn)數(shù)據(jù)計(jì)算得不同栽培方式銀耳多糖中蛋白質(zhì)殘留量如圖2所示。

圖1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 不同栽培方式銀耳多糖中的蛋白質(zhì)殘留量

由圖2可知,兩種銀耳在純化后蛋白質(zhì)含量存在顯著差異(p<0.05),代料銀耳蛋白質(zhì)含量(2.65±0.05 mg/mL)顯著高于段木銀耳(0.45±0.06 mg/mL)(p<0.05)。說明兩種栽培方式銀耳在某些限定營養(yǎng)成分方面存在一定的差異。

2.1.2 不同栽培方式銀耳多糖得率 以吸光度為縱坐標(biāo),葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。根據(jù)圖3,得回歸方程為:Y=0.0056X+0.0027,R2=0.9998。在脫蛋白后和透析后兩種不同栽培方式銀耳多糖得率及含糖量測定結(jié)果如表1。

圖3 葡萄糖溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)表1得出,脫蛋白后,段木銀耳的多糖得率顯著高于代料銀耳(p<0.05),分別為28.66%±2.33%、26.18%±1.13%;代料銀耳的含糖量顯著高于段木銀耳(p<0.05),分別為50.32%±1.61%、46.57%±0.46%。透析后,段木銀耳的多糖得率顯著高于代料木耳(p<0.05),含糖量無顯著差異(p>0.05),且都超過了80%。透析前后的多糖含糖量(等同純度)存在明顯差距,且透析后遠(yuǎn)高于透析前,可以推測出透析為除去蛋白質(zhì)的重要過程,且試驗(yàn)透析結(jié)果較優(yōu)。

表1 不同栽培方式銀耳多糖得率及含糖量Table 1 Polysaccharide yield and sugar content in different cultivation methods of Tremella fuciformis

2.1.3 不同栽培方式銀耳多糖硫酸根離子、糖醛酸含量 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4),計(jì)算得回歸方程為:Y=0.2176X+0.0031,R2=0.9911。

圖4 硫酸根含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5),計(jì)算得回歸方程為:Y=0.0102X+0.0096,R2=0.9978。

圖5 葡萄糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

代料與段木銀耳糖醛酸、硫酸根含量(%)如圖6。由圖6可知,段木銀耳硫酸根含量和糖醛酸含量都高于代料銀耳,由差異性分析表明存在顯著性差異(p<0.05),由此推斷栽栽培方式的不同對銀耳硫酸根、糖醛酸含量均有一定的影響。

圖6 不同栽培方式銀耳多糖硫酸根、糖醛酸含量

硫酸根和糖醛酸含量被較多文獻(xiàn)報(bào)道證實(shí)與生物活性為正相關(guān)的關(guān)系[21]。而糖醛酸的含量是判斷此多糖是否為酸性多糖的一個(gè)重要指標(biāo)。硫酸根屬于多糖的一個(gè)特征基團(tuán),帶有硫酸基團(tuán)的糖的復(fù)合物(如蛋白聚糖、糖蛋白以及硫酸酯化多糖)是一大類很重要的活性物質(zhì),具有提供機(jī)體的細(xì)胞免疫、抗病毒和體液免疫功能以及延緩衰老等作用。王琪[22]的報(bào)道證實(shí),多糖中硫酸根含量與其功效有密切聯(lián)系,同時(shí)硫酸根含量越高,功效越好。

2.2 不同栽培方式銀耳多糖的單糖組成分析

2.2.1 各單糖標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖 各單糖標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖見圖7。

圖7 各單糖標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖

2.2.2 堿提法所得不同栽培方式銀耳多糖的單糖組成及圖譜

表2 單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

Table 2 Standard curve of monosaccharide

單糖組成線性方程決定系數(shù)R2鼠李糖y=4.110x-0.13210.9978巖藻糖y=2.795x-10.8960.9976甘露糖y=4.898x-3.47750.9988木糖y=5.111x-4.23460.9989半乳糖y=6.132x-22.4350.9908葡萄糖y=5.243x-11.3010.9945葡萄糖醛酸y=4.460x-19.1870.9955

由表3、圖8可知,兩種栽培方式銀耳多糖均含有甘露糖、葡萄糖、木糖、葡萄糖酸。其中代料與段木栽培方式中甘露糖含量都最多,其次是木糖和葡萄糖,且代料栽培銀耳的甘露糖、木糖與葡萄糖含量都大于段木栽培銀耳,葡萄糖醛酸含量差別不明顯。銀耳多糖的單糖組成是決定銀耳多糖一級結(jié)構(gòu)的重要指標(biāo),堿式提取的兩種銀耳多糖的單糖結(jié)構(gòu)無較大差別,即多糖結(jié)構(gòu)特征亦無太大差別,其他單糖含量均較少,所以由實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測,此銀耳多糖可能是以甘露糖為主鏈,木糖和葡萄糖醛酸等單糖作為輔鏈的酸性雜多糖。

圖8 堿提法所得銀耳多糖的氣相色譜圖

表3 不同栽培方式銀耳多糖的單糖組分Table 3 Monosaccharide components of Tremella fuciformis in different cultivation methods

2.3 不同栽培方式銀耳多糖的抗氧化活性分析

2.3.1 不同栽培方式銀耳多糖清除DPPH自由基的能力 不同栽培方式銀耳多糖DPPH自由基清除率隨放置時(shí)間的變化曲線如圖9所示。由圖9可知,隨著反應(yīng)時(shí)間增大,DPPH自由基清除率也逐漸增大,最后在一個(gè)范圍內(nèi)無太大波動(dòng),說明時(shí)間越長,對自由基的清除能力越趨于穩(wěn)定。在反應(yīng)5～10 h時(shí)間段內(nèi),DPPH自由基清除率迅速增大,且在反應(yīng)時(shí)間13 h之后趨于穩(wěn)定,由此可得反應(yīng)時(shí)間為13 h最佳。由圖9可知,VC對于DPPH自由基的清除率為68.57%,在兩種銀耳DPPH清除率趨于穩(wěn)定時(shí),段木銀耳多糖的DPPH自由基清除率比代料銀耳高3%,二者分別為44.80%、41.80%。

圖9 不同栽培方式銀耳多糖DPPH自由基清除率隨放置時(shí)間的變化

2.3.2 不同栽培方式銀耳多糖清除羥自由基的能力 結(jié)合圖10～圖11進(jìn)行差異性分析可知,兩種栽培方式銀耳對于羥自由基的清除率無顯著性差異(p>0.05),代料銀耳羥自由基清除率比段木銀耳高0.25%,二者分別為46.82%±0.08%、46.57%±1.60%。表明采用相同提取方法時(shí),兩種銀耳多糖的抗氧化能力無顯著差異,猜測其生長環(huán)境與栽培方式對抗氧化能力無太大影響;但可能在不同提取方式下會(huì)有差異,這部分研究有待進(jìn)一步深入。

圖10 VC清除羥自由基的標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖11 不同栽培方式銀耳多糖羥自由基清除率

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用堿提法提取代料銀耳和段木銀耳多糖,通過測定多糖的理化性質(zhì)及體外抗氧化活性,比較兩種栽培方式銀耳生物活性以及理化性質(zhì)的差異。結(jié)果表明,透析后的多糖蛋白質(zhì)含量極少,可以認(rèn)為純化后多糖中幾乎不含蛋白質(zhì)。由質(zhì)量比結(jié)果分析可推測,銀耳多糖是以甘露糖為主鏈,木糖、葡萄醛酸為輔鏈的酸性雜多糖,代料銀耳與段木銀耳多糖中葡萄糖的質(zhì)量比為13.62∶2.43。單糖組成影響著多糖的結(jié)構(gòu),單糖組成的不同表明化學(xué)組成不同,由此可推測得出兩種栽培方式銀耳化學(xué)組成無太大差異。根據(jù)對銀耳多糖的硫酸根含量、糖醛酸含量、DPPH自由基和羥自由基清除能力的測定可知,段木銀耳多糖和代料銀耳多糖在堿式提取下生理活性差異基本不明顯,由此可得出不同栽培方式對多糖抗氧化活性無太大影響。由結(jié)果可知,銀耳多糖在DPPH自由基與羥自由基清除能力中起著主導(dǎo)作用,可作為一種天然的自由基清除劑。