徐丹丹 王 剛

黑龍江省五大連池市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，黑龍江五大連池 164100

NOD2是近年來才被發(fā)現(xiàn)的哺乳動物固有免疫受體之一的NLRs（NOD-like receptors）家族中重要的一員，它通過識別細(xì)菌的細(xì)胞壁成分——胞壁酰二肽（muramyl dipeptide，MDP），從而激活下游的炎癥信號通路，幫助機(jī)體抵抗外來病原的侵襲。NOD2受體參與機(jī)體抵抗葡萄球菌、志賀氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、嗜肺軍團(tuán)菌、李斯特菌等多種細(xì)菌感染。更有研究表明，NOD2還參與抵抗肺炎衣原體、呼吸道合胞體病毒及弓形蟲侵襲。奶牛乳腺中有NOD2的表達(dá)，但NOD2受體在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的具體位置仍沒有明確的報道。因此，本試驗采用膠原酶Ⅰ消化法體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞，分離純化并鑒定該細(xì)胞；采用免疫熒光技術(shù)對乳腺上皮細(xì)胞中的NOD2受體進(jìn)行定位，為今后研究NOD2受體在奶牛乳腺中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織來源

奶牛乳腺組織取自黑龍江省大慶市某屠宰場1頭因外傷淘汰的處于泌乳期的荷斯坦奶牛。

1.2 主要試劑

DMEM F/12培養(yǎng)基（GIBCO公司），胎牛血清（FBS）（Hyclone公司），膠原酶Ⅰ（Invivogen公司），胰蛋白酶（碧云天公司），NOD2抗體（Proteintech公司）。

1.3 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的體外培養(yǎng)

1）奶牛乳腺細(xì)胞的培養(yǎng)。取新鮮宰殺動物體內(nèi)乳腺組織為試驗材料，使用膠原酶I消化法制備奶牛乳腺上皮細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后，每2 d換液1次。

2）奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離純化。根據(jù)成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞對胰酶的耐受能力不同以及貼壁時間的差異分離純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞。

1.4 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的鑒定及NOD2定位

將純化后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞用NOD2抗體4℃孵育，加入對應(yīng)二抗與之結(jié)合，37℃作用1 h，PBS漂洗，加入細(xì)胞鑒定孔作用5～10 min后使用抗猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 奶牛乳腺細(xì)胞的培養(yǎng)與分離純化

奶牛乳腺細(xì)胞培養(yǎng)第3天時可看到生長狀態(tài)良好且分界明顯的乳腺上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)至第5天時細(xì)胞長滿至瓶底80%～90%。對細(xì)胞分離純化2～3次后，可見較為純凈的典型“鋪路石”或“鵝卵石”樣奶牛乳腺上皮細(xì)胞，細(xì)胞核及核仁（多為多核仁）清晰可見，且部分細(xì)胞已經(jīng)具有乳汁分泌功能（圖1）。

圖1 純化后的奶牛乳腺上皮細(xì)胞（100×）

2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中NOD2的定位

免疫熒光對乳腺上皮細(xì)胞NOD2定位結(jié)果顯示，NOD2多位于細(xì)胞核，尤其以核仁表達(dá)量最高，且具有乳汁分泌功能的乳腺上皮細(xì)胞核仁中NOD2的表達(dá)量要高于非泌乳乳腺上皮細(xì)胞（圖2a、圖 2b）。

圖2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞中NOD2的定位結(jié)果（200×）

3 討論

乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)歷史至今已有近60年。相關(guān)文獻(xiàn)表明，酶消化法易破壞奶牛乳腺組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)，不宜培養(yǎng)成功或即使培養(yǎng)成功傳代次數(shù)也較少，這可能由于操作時沒有控制好酶濃度或消化時間。這就要求我們采用酶消化法培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞時，根據(jù)組織來源、組織狀態(tài)以及酶的質(zhì)量合理控制消化時間，保證奶牛乳腺上皮細(xì)胞能夠正常貼壁生長。奶牛乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)結(jié)果顯示，采用膠原酶Ⅰ消化法，經(jīng)分離純化后成功獲得了較為純凈的奶牛乳腺上皮細(xì)胞[1]，且生長狀態(tài)良好，可以用于后續(xù)試驗。

Whelehan等[2]研究，NOD2存在于奶牛乳腺腺泡、乳導(dǎo)管、乳池及乳頭組織。近年來的相關(guān)研究證實，NOD2基因的突變與克羅恩病及Blau綜合征等疾病密切相關(guān)，目前NOD2在奶牛乳腺中的作用研究的仍較少。本試驗首次對奶牛乳腺上皮細(xì)胞中NOD2受體進(jìn)行定位，結(jié)果顯示，奶牛乳腺上皮細(xì)胞中NOD2受體多存在于細(xì)胞核且主要集中在核仁中，同時發(fā)現(xiàn)具有泌乳功能的乳腺上皮細(xì)胞中NOD2的表達(dá)量明顯高于非泌乳乳腺上皮細(xì)胞，這可能是奶牛在泌乳期提高乳腺免疫防御機(jī)能的一種體現(xiàn)，但這種機(jī)能的體現(xiàn)受何種因素調(diào)控以及存在于核仁的NOD2受體是否參與rRNA合成和核糖體組裝還有待于進(jìn)一步研究。

總之，本試驗采用膠原酶Ⅰ消化法成功獲得了生長狀態(tài)良好的奶牛乳腺上皮細(xì)胞，且對奶牛乳腺上皮細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光定位，這些結(jié)果為研究NOD2在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中的作用提供了很好的理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。