王旺 李遠鋒 林影 梁書利

摘 要：為了確定植酸酶發(fā)酵過程中最合適的甲醇流加速率，對畢赤酵母工程菌15L罐發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的工藝條件進行了研究，通過控制3種甲醇流加速率，探討不同甲醇流加速率條件下的畢赤酵母工程菌的植酸酶產(chǎn)量。

關(guān)鍵詞：畢赤酵母;植酸酶;甲醇流加速率;發(fā)酵優(yōu)化

中圖分類號：TQ922 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）09-0254-03

植酸酶（EC 3.1.3.8或EC 3.1.3.26）是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸（磷酸鹽）的酶類總稱，一方面它可以有效提高動物對磷的吸收利用率，提高飼料的營養(yǎng)價值;另一方面可減少動物糞便中磷排泄量，從而減少環(huán)境的磷污染[1]。目前，養(yǎng)殖業(yè)對植酸酶的需求越來越大，2010年國際植酸酶峰會報道，全球植酸酶市場占飼料酶市場60% 以上，產(chǎn)值3.5億美元/年，家禽和豬飼料大約70%都添加植酸酶[2]。與此同時，植酸酶的生產(chǎn)成本也日益受到關(guān)注[3]。因此，提高植酸酶產(chǎn)量并降低其生產(chǎn)成本成為當(dāng)前植酸酶研究和生產(chǎn)的重要課題。

畢赤酵母產(chǎn)植酸酶發(fā)酵工藝的優(yōu)化已有許多相關(guān)報道。趙凱等[3，4]考察了不同比生長速率和誘導(dǎo)濕重對重組畢赤酵母基因工程菌Mut+發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的影響。閔兆升等[5]采用單因素試驗和正交試驗對畢赤酵母工程菌H311產(chǎn)植酸酶的發(fā)酵工藝條件進行了優(yōu)化。黃魁英等[6]對耐高溫植酸酶畢赤酵母工程菌PEY-2中試發(fā)酵條件進行了研究。

甲醇流加對微生物發(fā)酵影響的研究也有報道。李清亮等[7]考察了5L發(fā)酵罐中三種甲醇流加策略（恒溶氧、恒比生長速率和恒甲醇濃度）對重組畢赤酵母表達人肝再生增強因子（hALR）的影響，實驗結(jié)果表明控制恒定甲醇濃度進行誘導(dǎo)發(fā)酵，甲醇比消耗速率和hALR表達速率顯著高于其它兩種流加策略。陳多等[8]依據(jù)已有畢赤酵母發(fā)酵動力學(xué)模型，設(shè)定最優(yōu)化問題，利用迭代循環(huán)確定最優(yōu)乘子并求解最優(yōu)甲醇流加軌跡，實驗證明優(yōu)化后的甲醇流加方法可以使畢赤酵母表達的鼠李糖苷酶產(chǎn)量提高15%。王水蓮等[9]考察了不同甲醇流加濃度對重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸（SAMe）的影響，在發(fā)酵過程中控制發(fā)酵液中甲醇濃度并測定外源蛋白表達量，實驗結(jié)果表明當(dāng)補加甲醇的量為0.5%時腺苷蛋氨酸表達量最高。

畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的過程中，甲醇作為發(fā)酵過程中的碳源和誘導(dǎo)劑，其流加策略、流加速率及誘導(dǎo)方式都直接影響菌體的生長與外源蛋白的表達。當(dāng)甲醇流加速率過低時，甲醇濃度不足，菌體的生長和外源蛋白的表達都將受到抑制，而甲醇流加速率過高則會造成菌體中毒，抑制菌體生長時[10]。目前，通過甲醇流加速率控制甲醇濃度對畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶方面的研究未見報道。本文研究了3.5g/（L·h）、5.5g/（L·h）、7.5g/（L·h）這3種甲醇流加速率下，畢赤酵母工程菌GAP-P180-AOX-HAC1-YNP01（簡寫為GAY1）的生長與產(chǎn)酶變化，確定了最適合畢赤酵母工程菌GAY1發(fā)酵積累植酸酶的甲醇流加速率。

1 儀器與材料

1.1 實驗材料

（1）菌株。菌株為前期工作所構(gòu)建的基因工程菌株GAY1（基于畢赤酵母，通過基因改造手段獲得），華南理工大學(xué)酶學(xué)與酶工程實驗室保種。（2）試劑。酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、十二烷基苯磺酸鈉（SDS）、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、無氨基酵母氮源YNB（含硫酸銨）、生物素、丙烯酰胺、四甲基乙二胺（TEMED）、過硫酸銨、甲醇、甘油、釩酸銨、鉬酸銨、硝酸、乙酸、乙酸鈉、植酸鈉。（3）培養(yǎng)基和終止顯色液。YPD種子培養(yǎng)基（1L）：10g酵母粉，20g蛋白胨，10g葡萄糖。

BSM發(fā)酵培養(yǎng)基：1.49%（W/V）七水硫酸鎂，0.094%（W/V）硫酸鈣，1.82%（W/V）硫酸鉀，2.67%（V/V）磷酸，0.413%（W/V）氫氧化鉀，4%（W/V）甘油，121℃蒸汽滅菌30min，冷卻至30℃，添加0.435%（V/V）PTM1。

PTM1微量元素溶液：0.08g碘化鈉，6.00g五水硫酸銅，0.02g硼酸，20.00g氯化鋅，3.00g一水硫酸錳，0.20g二水鉬酸鈉，0.50g氯化鈷，0.20g生物素，65.00g七水硫酸亞鐵，1mL濃硫酸，用去離子水定容至1L，再用0.22μm孔徑無菌水相濾膜過濾，4℃保藏備用。

硝酸溶液：濃硝酸與水按體積比1：2混合均勻。

終止顯色液：硝酸、100g/L鉬酸銨、2.35g/L釩酸銨按體積比2：1：1混合，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2 方法

（1）種子培養(yǎng)。將保藏菌種接種到Y(jié)PD平板上劃線，30℃培養(yǎng)24h，從平板培養(yǎng)基上挑取酵母單克隆接種于10mL YPD液體培養(yǎng)基中，在30℃，250r/min條件下培養(yǎng)18-24h，再按照10%接種量接種YPD培養(yǎng)基擴培18-24h，然后按照8%接種量接入發(fā)酵罐BSM培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)。（2）發(fā)酵控制。甘油生長階段流加氨水控制pH5.5，溫度設(shè)定為30℃。甘油耗盡后通過流加含12mL/L微量鹽（PTM1）培養(yǎng)基的50%的甘油增加菌濃，控制相同菌體OD600（200左右）開始誘導(dǎo)，根據(jù)實驗需求和測量的菌濃控制不同的甲醇流加速率3.5g/（L·h）、5.5g/（L·h）、7.5g/（L·h）進行相應(yīng)的甲醇補料誘導(dǎo)植酸酶表達。此時，流加氨水控制pH6.0，溫度設(shè)定為25℃。每隔8h取樣測測量。（3）分析方法。生長檢測。用OD600表示菌體生長，取發(fā)酵液利用UV2350型紫外分光光度儀，在波長600nm處檢測吸光值。

酶活測定。酶活測定采用鉬釩酸銨法[11]。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲醇流加速率為3.5g/（L·h）時的發(fā)酵情況

發(fā)酵液底料中含有4%的甘油，甘油耗盡之后DO回升，此時開始流加50%的甘油直至誘導(dǎo)所需OD600為250（大約發(fā)酵時間30h），之后停止流加甘油，饑餓60min左右，開始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶。初始甲醇流加速度為1g/（L·h），每兩小時提高0.5g/（L·h），直到甲醇流加速度為3.5g/（L·h）時，停止繼續(xù)提高，并以該流速流加至發(fā)酵結(jié)束。該流加速度下的發(fā)酵情況如圖1。

由圖1可知，發(fā)酵到40h，菌體OD600達到259，開始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，隨后菌體OD600和酶活隨發(fā)酵時間增加而增加，發(fā)酵至176h下罐時，菌體OD600達到460，植酸酶酶活達到24698U/mL。

2.2 甲醇流加速率為5.5g/（L·h）時的發(fā)酵情況

甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶之前的過程同2.1。初始甲醇流加速度為1g/（L·h），每兩小時提高0.5g/（L·h），直到甲醇流加速度為5.5g/（L·h）時，停止繼續(xù)提高，并以該流速流加至發(fā)酵結(jié)束。該流加速度下的發(fā)酵情況如圖2。

由圖2可知，發(fā)酵到40h，菌體OD600達到252，開始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，隨后菌體OD600和酶活隨發(fā)酵時間增加而增加，發(fā)酵至144h菌體OD600達到最大579，發(fā)酵至168h酶活達到最大26386U/mL，相較于甲醇流加速率3.5g/（L·h）酶活提高了6.83%，OD600提高了25.87%。發(fā)酵至176h下罐時，菌體OD600為511，酶活25864U/mL。

2.3 甲醇流加速率為7.5g/（L·h）時的發(fā)酵情況

甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶之前的過程同2.1。初始甲醇流加速度為1g/（L·h），每兩小時提高0.5g/（L·h），直到甲醇流加速度為7.5g/（L·h）時，停止繼續(xù)提高，并以該流速流加至發(fā)酵結(jié)束。該流加速度下的發(fā)酵情況如圖3。

由圖3可知，發(fā)酵到40h，菌體OD600達到238，開始流加甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶，隨后菌體OD600和酶活隨發(fā)酵時間增加而增加，發(fā)酵至152h菌體OD600達到最大578，發(fā)酵至160h酶活達到最大22108U/mL，相較于甲醇流加速率3.5g/（L·h）OD600提高了25.65%但酶活降低了10.49%，而相較于甲醇流加速率5.5g/（L·h）OD600相近，但酶活降低了16.21%。發(fā)酵至176h下罐時，菌體OD600為518，酶活21863U/mL。

綜合以上分析，可以推斷出甲醇流加速率3.5g/（L·h）條件下，甲醇流加量不足，菌體的生長和酶活都受到限制。甲醇流加速率7.5g/（L·h）條件下，雖然菌體生長所需的營養(yǎng)充足，菌體生長不再受限，但甲醇積累量偏高，抑制了植酸酶酶活。甲醇流加速率5.5g/（L·h）條件下菌體生長所需營養(yǎng)物質(zhì)充足，植酸酶酶活也未受到影響，因此，甲醇流加速率5.5g/（L·h）最適合畢赤酵母工程菌GAY1發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶。

3 結(jié)語

該試驗通過控制溫度、pH等，改變誘導(dǎo)階段甲醇流加速率的發(fā)酵條件，探討了畢赤酵母工程菌GAY1發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的生長與產(chǎn)酶規(guī)律，發(fā)現(xiàn)5.5g/（L·h）甲醇流加速率條件下，菌體在整個發(fā)酵過程中菌體生長和植酸酶酶活都處于更理想的狀態(tài)，得出結(jié)論：甲醇流加速率5.5g/（L·h）最適合于畢赤酵母工程菌GAY1發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶。該試驗確定畢赤酵母工程菌發(fā)酵過程中甲醇流加速率的控制策略，建立了基因工程菌株產(chǎn)植酸酶能力的評價體系，對植酸酶的實際工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)具有參考價值。

參考文獻

[1] 王仁華，謝益根，練小華.淺談植酸酶在動物生產(chǎn)中的應(yīng)用[J].江西飼料，2016（05）：8-10.

[2] Lei X G， Weaver J D， Mullaney E， et al. Phytase， a new life for an “old” enzyme[J]. Annu. Rev. Anim. Biosci.，2013，1（1）：283-309.

[3] 趙凱，葛菁華，王海.不同比生長速率對畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的影響[J].山東科學(xué)，2018，31（05）：43-47.

[4] 趙凱，葛菁華，王海.不同濕重誘導(dǎo)對畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶的影響[J].山東科學(xué)，2018，31（04）：85-88+109.

[5] 閔兆升，郭會明，張志強，洪厚勝.重組畢赤酵母產(chǎn)植酸酶發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].生物加工過程，2015，13（03）：31-35.

[6] 黃魁英，夏楓耿，黃樂天，明飛平，杜少平.耐高溫植酸酶畢赤酵母工程菌發(fā)酵中試條件優(yōu)化[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（10）：1238-1241.

[7] 李清亮，周月涵，丁健，段作營，金堅，李華鐘.畢赤酵母GS115表達HSA-GCSF～m的誘導(dǎo)工藝研究[J].工業(yè)微生物，2016，46（02）：8-13.

[8] 陳多，張湜，陳文亮，嚴(yán)明.畢赤酵母表達鼠李糖苷酶的甲醇流加方式優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2013，34（09）：157-159+163.

[9] 王水蓮，張建勇，劉杰，高振.不同甲醇流加策略對重組畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)腺苷蛋氨酸的影響[J].齊魯藥事，2006（12）：756-757.

[10] Khatri N K ， Hoffmann F . Impact of methanol concentration on secreted protein production in oxygen-limited cultures of recombinant Pichia pastoris[J]. Biotechnology & Bioengineering，2010，93（5）：871-879.

[11] 楊平平，王燕，史寶軍，陶文沂.對發(fā)酵生產(chǎn)植酸酶過程中植酸酶活性測定方法的初步探討[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2003（09）：52-55.