周定婷，馬蓁，許江彬，崔文欣，胡新中

(陜西師范大學(xué) 食品工程與營(yíng)養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安，710119)

豌豆是一種以蛋白質(zhì)和淀粉為主的豆科植物，在世界各地廣泛種植，其產(chǎn)量在豆科類農(nóng)作物中排名第四，僅低于黃豆、花生和大豆。豌豆淀粉是豌豆提取蛋白質(zhì)后的副產(chǎn)物，價(jià)格便宜，與玉米、小麥和馬鈴薯淀粉相比，其直鏈淀粉含量較高，形成的凝膠強(qiáng)度大，糊化溫度高[1-2]。豌豆淀粉主要用于紡織、輕化和醫(yī)藥工業(yè)中，除大多用于替代綠豆淀粉制作粉絲外，在食品中由于其功能性較差而應(yīng)用較少[3-4]。改性淀粉的加工處理方法較多，例如：微波輻射處理[5-6]、高壓處理及高壓循環(huán)處理[7-8]、超聲處理[9]、酸解處理[10]、脫支酶酶解處理[11-12]、濕熱處理[13]和多種方法聯(lián)合使用等。有關(guān)消化過(guò)程中改性淀粉結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變及機(jī)理的研究很少。鑒于個(gè)體小腸轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間存在明顯差異，研究人員已建立了幾種模擬淀粉體內(nèi)消化過(guò)程模型。有報(bào)道稱，對(duì)酶消化的抗性是酶水解動(dòng)力學(xué)與直鏈淀粉還原動(dòng)力學(xué)競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，加工過(guò)的高直鏈淀粉在消化過(guò)程中可能形成抗性淀粉。因此，研究改性淀粉在消化過(guò)程中結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變具有重要意義。

前期研究發(fā)現(xiàn)，超聲高壓聯(lián)合處理對(duì)豌豆淀粉結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)影響較大，可在一定程度上提高樣品中抗性淀粉的含量，降低食品的血糖生成指數(shù)，同時(shí)提高改性淀粉的熱加工穩(wěn)定性。超聲波振動(dòng)的能量在傳播過(guò)程中會(huì)被聚合物吸收，從而使分子中所含的能量提高，這對(duì)直鏈淀粉的重結(jié)晶具有積極作用。壓熱處理法能將淀粉充分糊化，且制備工藝簡(jiǎn)單，是最通用、經(jīng)濟(jì)的制備方法；超聲波安全無(wú)污染，也逐步被應(yīng)用于淀粉改性中。在超聲波預(yù)處理作用下，雖然淀粉顆粒中有部分直鏈淀粉溢出，但支鏈淀粉中的α - (1, 6) 糖苷鍵的存在會(huì)阻礙直鏈淀粉相互接近[14-15]。經(jīng)過(guò)壓熱處理后，支鏈淀粉溶解膨脹，直鏈淀粉完全溶出[16]。超聲和高壓復(fù)合處理的最終目的是破壞原豌豆淀粉的結(jié)構(gòu)，使豌豆淀粉分子更大程度地降解為分子鏈較小的，分子量分布較均一的淀粉分子，便于在后期的老化過(guò)程中形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。本研究將豌豆淀粉進(jìn)行超聲-高壓處理，分析模擬體內(nèi)消化過(guò)程中不同消化階段淀粉殘余物，利用環(huán)境掃描電子顯微鏡、X射線衍射、傅里葉紅外光譜觀察改性豌豆淀粉在消化過(guò)程中形貌和結(jié)晶區(qū)的變化，同時(shí)分析消化過(guò)程中改性淀粉理化性質(zhì)的改變，包括凍融穩(wěn)定性等與結(jié)構(gòu)變化之間的關(guān)系，闡述消化時(shí)間與結(jié)構(gòu)、物理性質(zhì)變化之間的關(guān)系，結(jié)構(gòu)的變化與物理性質(zhì)之間的關(guān)系，為擴(kuò)大豌豆淀粉應(yīng)用范圍提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豌豆淀粉,四川成都城東王食品有限公司;α-淀粉酶(10 080-25G,50 U/mg)、胰酶(P7545)和葡萄糖苷酶(10115-5G-F，70 U/mg),Sigma試劑公司;人總膽汁酸檢測(cè)試劑盒,上海Elisa生物試劑有限公司;其余的試劑均為分析純,西安晶博試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LD2X-30KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠；DK-S26型電熱恒溫水浴鍋,上海申賢恒溫設(shè)備廠；BSA124S型電子分析天平,德國(guó)賽多利斯公司；PHSJ-3F型pH計(jì),上海雷磁儀器廠；L6/L6S型紫外可見分光光度計(jì),上海儀電分析儀器有限公司；Multiskan Go全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀,美國(guó)熱電公司；真空冷凍干燥機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；D8 advance粉末X-射線衍射儀,德國(guó)BRUKER公司；Tensor 27紅外光譜儀,德國(guó)BRUKER公司；Quanta 200環(huán)境掃描電子顯微鏡,美國(guó)FEI公司；Q600 SDT型熱分析系統(tǒng),美國(guó)TA公司；SB-500DTY超聲波多頻清洗機(jī),寧波生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 超聲-高壓處理豌豆淀粉

稱取豌豆淀粉180 g，加入蒸餾水400 mL [m(淀粉)∶V(蒸餾水)=9∶20]混合成淀粉乳，置于超聲儀器中(25 ℃)處理60 min，功率為600 W，然后將其放入高壓滅菌鍋中(121 ℃)壓熱處理30 min，冷卻至室溫后放入冰箱中(4 ℃)老化處理24 h?；厣匣Y(jié)束后，于45 ℃烘干24 h，烘干后的樣品粉碎過(guò)100目篩，待用。

1.3.2 體外模擬消化

參照張娟等[17]的方法。將1.5 g淀粉樣品加入到30 mL磷酸緩沖溶液(0.2 mol/L, pH 5.8)中混勻，加入2 mL質(zhì)量濃度為100 g/L的胃蛋白酶(由0.2 mol/L, pH 5.8磷酸緩沖液配制)，搖勻，置于恒溫水浴振蕩器中37 ℃酶解30 min，離心棄上清液，加入30 mL磷酸緩沖液(0.2 mol/L, pH 6.9)和2 mL質(zhì)量濃度為1 g/L的α-淀粉酶(由0.2 mol/L, pH 6.9磷酸緩沖液配制)，37 ℃下水浴10 min，離心后棄上清，于沉淀中加入由200 mg胰酶、100 μL葡萄糖苷酶和30 mL醋酸緩沖液(0.2 mol/L, pH 5.2)混合的溶液，37 ℃下振蕩水浴。樣品于不同時(shí)間(0 min、10 min、30 min、1 h、2 h、4 h、8 h、18 h)取出加入等量的95%乙醇終止反應(yīng)，離心棄上清液，用蒸餾水和醋酸緩沖液各洗滌1遍，冷凍干燥后研磨過(guò)100目篩，待測(cè)。

1.3.3 環(huán)境掃描電子顯微鏡(ESEM)

取少量淀粉樣品粉末，用導(dǎo)電膠固定在金屬臺(tái)后，用離子迸射儀進(jìn)行噴金處理，然后用環(huán)境掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)特征，取一定的倍數(shù)拍攝適當(dāng)區(qū)域的樣品(×1 000倍)。

1.3.4 X-射線衍射分析(XRD)

取一定量的淀粉樣品于樣品凹槽中，利用X射線衍射儀在40 kV電壓和40 mA電流條件下觀察超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)不同消化時(shí)間后的結(jié)晶特性， X衍射源特征線是Cu-Kα輻射，衍射角2θ的掃描范圍是4～40°，掃描速度為2°/min。

1.3.5 傅里葉紅外變換光譜(FT-IR)

取一定量的淀粉樣品與溴化鉀于瑪瑙研缽中研磨[m(樣品)∶m(溴化鉀)=1∶100],采用溴化鉀壓片法制成薄片，置于樣品架上，利用傅里葉紅外變換光譜儀觀察超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)不同消化時(shí)間后的短鏈結(jié)構(gòu)。紅外光譜儀波長(zhǎng)范圍為400～4 000 cm-1，速度為4 cm-1/s。

1.3.6 熱特性分析(DSC)

稱取約10 mg淀粉樣品放入鋁鉗鍋中,用進(jìn)樣器向坩堝中加入蒸餾水[m(淀粉)∶m(水)=1∶5]，對(duì)樣品進(jìn)行壓蓋密封處理,室溫條件下靜置平衡24 h,測(cè)試條件:溫度范圍20～160 ℃,升溫速率10°/min。

1.3.7 膽酸結(jié)合能力

參照KIM等[18]的方法。用35%的膽酸鈉、35%的脫氧膽酸鈉、15%的甘氨膽酸鈉和15%的?；悄懰徕c制備膽酸混合物。將混合物溶解于50 mmol磷酸鹽緩沖液(pH 6.9)中,配制成 1.4 mmol/L的膽酸混合溶液。取一定量胰酶溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制為6.25 mg/mL的溶液。將5 mg的淀粉樣品放入試管中，分別用0.1 mL的0.01 mol/L HCl于37 ℃水浴中振蕩1 h。然后用0.1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH至7。繼而加入0.4 mL的膽酸混合物溶液和0.5 mL的胰酶溶液,37 ℃水浴振蕩1 h。每個(gè)試管中加入5 mL磷酸鹽緩沖液， 3 000 r/min離心10 min，上清液轉(zhuǎn)移到新管。沉淀物中加入5 mL磷酸鹽緩沖液，重復(fù)離心，混合上清液。游離的膽酸含量由人總膽汁酸酶聯(lián)免疫分析(TBA ELISA)試劑盒檢測(cè)。將混合物稀釋到測(cè)試試劑盒和標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)。最后，用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算每個(gè)樣品溶液的濃度。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.3.8 凍融穩(wěn)定性

取一定量的樣品配制60 g/L的淀粉乳(絕干淀粉加水)置于沸水浴中加熱20 min，冷卻至室溫后置于冰箱(4 ℃)中16 h，繼而放于-20 ℃下冷凍24 h后，取出自然解凍，3 000 r/min離心20 min，棄去上清液，稱沉淀物的質(zhì)量并計(jì)算。

1.3.9 透光率

取一定量的樣品配制為60 g/L的淀粉乳(絕干淀粉加水)于沸水浴中加熱攪拌30 min，在30 ℃下冷卻1 h后，以蒸餾水為空白對(duì)照，測(cè)定淀粉乳在620 nm下的透光率。

1.3.10 統(tǒng)計(jì)與分析

所有數(shù)據(jù)分析采用ANOVA, TUKEY, DUNCAN和Data Processing Station (DPS) 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差(P<0.05)，數(shù)據(jù)3次平行重復(fù)，用Origin 8.0作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲-高壓處理后的抗性淀粉經(jīng)不同時(shí)間消化后的結(jié)晶結(jié)構(gòu)

由文獻(xiàn)[3]可知，豌豆淀粉晶體為典型的C型結(jié)構(gòu)，即淀粉晶體結(jié)構(gòu)中既有A-型結(jié)構(gòu)又有B-型結(jié)構(gòu)。經(jīng)過(guò)超聲-高壓處理后，抗性淀粉樣品在17°(圖1)左右有一個(gè)較強(qiáng)的衍射峰，為典型的B-型結(jié)構(gòu)。這說(shuō)明超聲-高壓處理破壞了豌豆淀粉的A-型結(jié)構(gòu)。

圖1 豌豆淀粉和超聲高壓處理后抗性淀粉的X射線衍射分析圖Fig.1 X-ray diffraction spectrums of pea starch of native and treated starch by ultrasonic-autoclaving

淀粉經(jīng)不同時(shí)間的體外消化處理后，與超聲-高壓抗性淀粉相似，所有樣品在17°左右均有較強(qiáng)的衍射峰，表現(xiàn)為B-型結(jié)晶。這說(shuō)明，體外消化處理不會(huì)改變超聲-高壓抗性淀粉的結(jié)晶類型。也有文獻(xiàn)指出[19-20]，B-型結(jié)晶對(duì)淀粉酶的耐受性更強(qiáng)，且有報(bào)道指出結(jié)晶類型僅與其回生方式有關(guān)[21]。超聲-高壓抗性淀粉在19.86°處有弱小衍射峰，代表抗性淀粉顆粒中有V型結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)可能是因?yàn)橥愣沟矸壑械闹辨湹矸叟c少量的脂質(zhì)形成了直鏈淀粉-脂質(zhì)復(fù)合物[24]，也可能是因?yàn)橥愣沟矸墼诔?高壓處理之后受4 ℃回生重結(jié)晶的影響[26]。超聲-高壓抗性淀粉未被消化時(shí)不顯示V型結(jié)晶(圖2)，這可能是由于在消化處理過(guò)程中，胰酶的作用去除了淀粉中少量的脂類物質(zhì)，直鏈淀粉與脂類的交聯(lián)消失，從而導(dǎo)致了V型結(jié)構(gòu)的消失。

圖2 不同消化時(shí)間的超聲-高壓抗性淀粉的X射線衍射分析圖Fig.2 X-ray diffraction spectrums of treated pea starch at different digestion stages

淀粉樣品的相對(duì)結(jié)晶度如表1所示。從表1可以看出，隨著消化時(shí)間延長(zhǎng)，超聲-高壓抗性淀粉的相對(duì)結(jié)晶度也逐漸變大，這可能是因?yàn)槊傅南饔媒到饬顺?高壓抗性淀粉顆粒里面較為薄弱的無(wú)定形部分，從而使具有較好結(jié)晶結(jié)構(gòu)的抗酶解淀粉的相對(duì)比例增加，結(jié)晶度有所提高。但之后隨著消化時(shí)間(8 h)的延長(zhǎng)，結(jié)晶度沒有顯著增加(P<0.05)，說(shuō)明酶對(duì)底物的酶促作用變?nèi)?，結(jié)晶區(qū)域穩(wěn)定。結(jié)論與傅里葉的DO值趨勢(shì)一致，也進(jìn)一步說(shuō)明相對(duì)結(jié)晶度的增加與淀粉分子的鏈有序度有關(guān)[23]。

表1 不同消化時(shí)間樣品的FTIR的DD、DO值和XRD的相對(duì)結(jié)晶度Table 1 Molecular order and relative crystallinity oftreated pea starch at different digestion times by Fouriertransform infrared spectroscopy and X-raydiffraction (p<0.05)

2.2 傅里葉紅外變換分析

超聲-高壓抗性淀粉在不同時(shí)間消化后的分子有序度(DO)和雙螺旋程度(DD)如表1所示，可以明顯看出DO值隨著消化時(shí)間的增加逐漸變大，可能是因?yàn)榈矸劢?jīng)過(guò)消化后顆粒中不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)被酶解，淀粉直鏈雙螺旋結(jié)構(gòu)遭到酶的破壞，形成更多的直鏈淀粉或短鏈分子鏈，直鏈淀粉與直鏈淀粉、或者直鏈淀粉與酶解后支鏈淀粉所產(chǎn)生的短鏈分子鏈通過(guò)氫鍵相連，形成新的有序結(jié)構(gòu)[23，29]。且DO值緩慢從1.020增長(zhǎng)到1.106，可能是因?yàn)橄瘯r(shí)間控制的間隔較短且超聲-高壓處理得到的抗性淀粉結(jié)構(gòu)相對(duì)原豌豆淀粉更加緊密，從而導(dǎo)致了消化過(guò)程中DO值變化緩慢。結(jié)果與XRD中相對(duì)結(jié)晶度的變化一致，分子有序度越高，相對(duì)結(jié)晶度越大，說(shuō)明消化過(guò)程中無(wú)定形區(qū)被緩慢酶解，結(jié)晶區(qū)結(jié)構(gòu)因?yàn)橄鄬?duì)穩(wěn)定而沒有被破壞。

2.3 體外消化過(guò)程中超聲-高壓抗性淀粉的形貌結(jié)構(gòu)分析

圖4表示超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)不同消化時(shí)間后淀粉形貌結(jié)構(gòu)的變化。如圖4所示，消化未開始時(shí)淀粉的形狀都是比較小且不規(guī)則的，這可能是由于淀粉經(jīng)超聲-高壓處理后受熱膨脹，直鏈淀粉逐漸浸出，顆粒形態(tài)遭到破壞，老化過(guò)程中淀粉分子鏈通過(guò)氫鍵和范德華力作用相互靠近并重排重組成堅(jiān)硬的不規(guī)則晶體結(jié)構(gòu)碎片[30]。超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)消化2 h后，淀粉顆粒表面開始出現(xiàn)一些凹槽和脊?fàn)顥l形同時(shí)伴隨著細(xì)小的孔狀，這可能是因?yàn)榈矸郾砻娴膶訝罱Y(jié)構(gòu)隨著消化的進(jìn)行逐漸被酶解。而消化4 h以后到18 h，所有淀粉的表面都有孔狀和漩渦狀并且都變成了大包裹型。

圖3 不同消化時(shí)間的超聲-高壓抗性淀粉的FTIR光譜圖Fig.3 FTIR of treated pea starch at different digestion stages

圖4 不同消化時(shí)間淀粉的電鏡掃描圖Fig.4 Scanning electron microscope images of treated pea starch at different digestion times

2.4 體外消化過(guò)程中超聲-高壓抗性淀粉的熱特性分析

表2為超聲-高壓抗性淀粉經(jīng)不同消化時(shí)間后淀粉的熱特性變化。從表2中可以看出，隨著消化時(shí)間的增加，淀粉樣品的熱焓值(ΔH，kJ/g)隨體外消化時(shí)間的增長(zhǎng)也呈緩慢增加的趨勢(shì)，這可能是因?yàn)樵谙^(guò)程中淀粉顆粒結(jié)構(gòu)中的直鏈淀粉增加，并聚集形成結(jié)晶區(qū)，而其較支鏈淀粉晶體較難被破壞，故需要更高的能量。淀粉經(jīng)過(guò)超聲-高壓聯(lián)用處理后具有一定的酶抗性，故增加較緩慢[24，31]。

2.5 膽酸結(jié)合能力

膽酸是一種類膽固醇羧酸，由膽固醇在肝臟中合成，膳食纖維等聚合物與膽酸結(jié)合后，游離的膽酸含量降低，促進(jìn)肝臟中的膽固醇轉(zhuǎn)變成膽酸，也可以在小腸中通過(guò)結(jié)合膽酸來(lái)降低膽固醇水平，因此會(huì)增加糞便中的膽酸排泄，起到降低血漿總和及低密度脂蛋白水平的作用，從而降低心血管疾病的患病率[32]。表2中呈現(xiàn)出超聲-高壓抗性淀粉的膽汁酸結(jié)合能力隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，說(shuō)明淀粉經(jīng)過(guò)消化后形成的孔狀和漩渦狀可以很好地與膽酸結(jié)合。從淀粉的形貌結(jié)構(gòu)中也可以看出，隨著消化時(shí)間的增加，淀粉表面出現(xiàn)的孔狀和漩渦狀數(shù)增多。

表2 不同消化時(shí)間樣品的凍融穩(wěn)定性、透光度、糊化吸熱焓和膽汁酸結(jié)合力(n=3)Table 2 Freeze thaw stability，light transmittance，ΔHand bile acid binding of treated pea starch at differentdigestion times

2.6 透光率與凍融穩(wěn)定性

透光率即淀粉糊透明度,它反映了淀粉分子吸水膨脹及分子間的締合程度，也可以反映淀粉分子與水分子之間的結(jié)合能力。透光率與直鏈淀粉含量有關(guān)，直鏈淀粉含量越低，透明度越高；一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)?shù)矸鄯肿游浞峙蛎浐?，分子間不發(fā)生相互締合或者締合程度很低時(shí)，淀粉糊的透明度會(huì)很高，反之，透明度會(huì)很低[19，33]。從表2可以看到，透光率隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低，這可能是由于淀粉顆粒經(jīng)消化后直鏈淀粉含量增加，分子間的締合作用引起了光反射，這與樣品的熱焓值的變化的規(guī)律一致。

淀粉的凍融穩(wěn)定性是指淀粉乳液經(jīng)凍結(jié)和融化交替變化時(shí)的穩(wěn)定性，可由析水率反映，析水率是淀粉制品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，析水率越高凍融穩(wěn)定性越差，反之凍融穩(wěn)定性越好。隨著消化時(shí)間的增加，淀粉的凍融穩(wěn)定性越差，這可能與直鏈淀粉與支鏈淀粉的比值有關(guān)。

3 結(jié)論

豌豆淀粉經(jīng)過(guò)超聲-高壓處理后，淀粉的晶型由原來(lái)的C型變?yōu)锽+V型。體外消化后結(jié)晶型由B+V型轉(zhuǎn)變?yōu)锽型，說(shuō)明B型晶體的耐酶解能力更強(qiáng)。超聲-高壓抗性淀粉在體外消化過(guò)程中，抗性淀粉的無(wú)定形區(qū)被破壞，所以相對(duì)結(jié)晶度隨著消化時(shí)間的延長(zhǎng)而增加。超聲-高壓抗性淀粉體外消化后，豌豆抗性淀粉的分子有序度隨著消化時(shí)間的增加而增加；抗性淀粉平整的表面出現(xiàn)孔狀和旋渦狀，且隨消化時(shí)間的增長(zhǎng)，孔狀和旋渦狀結(jié)構(gòu)逐漸增多；超聲-高壓抗性淀粉的膽汁酸結(jié)合能力的提高隨消化時(shí)間的增長(zhǎng)呈緩慢升高趨勢(shì)，且與其形貌有關(guān)。超聲-高壓抗性淀粉的凍融穩(wěn)定性和熱焓值均隨消化時(shí)間的增長(zhǎng)而增加，而透光率則剛好相反，這可能與消化后淀粉被酶解形成了更多的直鏈淀粉有關(guān)。改性淀粉中直/支鏈淀粉的含量，分子量變化情況及其與改性淀粉的體外消化率的關(guān)系還需在后續(xù)研究中繼續(xù)探究。