祝偉霞＊， 孫轉(zhuǎn)蓮， 張丹， 馮景菲， 楊娜

(鄭州海關(guān)技術(shù)中心，鄭州450003)

1 引言

三文魚(yú)屬冷水性高度洄游魚(yú)類(lèi)，是世界名貴魚(yú)類(lèi)之一，三文魚(yú)以其獨(dú)特的口味、豐富的營(yíng)養(yǎng)，受到越來(lái)越多人的青睞，進(jìn)口量也快速增長(zhǎng)。據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，目前全球超過(guò)70%三文魚(yú)來(lái)自于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]?？兹甘G屬堿性三苯甲烷類(lèi)合成化學(xué)染料，主要用于防治魚(yú)類(lèi)的水霉病、爛鰓病以及寄生蟲(chóng)病[2]?？兹甘G在水生生物體內(nèi)可快速代謝為隱色孔雀石綠，研究證明孔雀石綠及其代謝物具有致癌、致突變、致畸的危害，在水生動(dòng)物體內(nèi)殘留時(shí)間長(zhǎng)，已成為近年來(lái)水體污染和水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重點(diǎn)監(jiān)控污染物[3]。為人類(lèi)身體健康，我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年第193號(hào)公告禁止將孔雀石綠作為殺蟲(chóng)和殺菌劑用于所有食品用動(dòng)物，歐盟、日本、美國(guó)也禁止孔雀石綠用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中。我國(guó)是三文魚(yú)的主要進(jìn)口國(guó)家，保障進(jìn)口食品的質(zhì)量安全，建立一種有效檢測(cè)孔雀石綠及其代謝物的方法具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前有關(guān)孔雀石綠及其代謝物的研究報(bào)道主要采用液相色譜法（HPLC）[4-7]和液相色譜質(zhì)譜/質(zhì)譜法[8-11]?？兹甘G及其代謝物具有不同的特征吸收，孔雀石綠特征吸收在618 nm可見(jiàn)光區(qū)，其代謝物特征吸收在267 nm紫外光區(qū)，同時(shí)具有熒光激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)，HPLC法同時(shí)測(cè)定兩種化合物時(shí)需要紫外串聯(lián)熒光檢測(cè)器才能完成[4]。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 19857-2005采用柱后衍生的方法，在PbO2作用下檢測(cè)孔雀石綠的總量。為了提高分析靈敏度，HPLC-MS/MS技術(shù)開(kāi)始用于養(yǎng)殖環(huán)境[8-10]、水產(chǎn)生物[3,11]中痕量孔雀石綠及其代謝物的分析，目前很少有關(guān)三文魚(yú)中孔雀石綠及其代謝物殘留量分析的文獻(xiàn)報(bào)道。本方法根據(jù)冰鮮三文魚(yú)樣品的特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了一種高選擇性的固相分散萃取凈化方法，可以快速、靈敏測(cè)定冰鮮三文魚(yú)中孔雀石綠及其代謝物總殘量。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器和試劑

API 5500Q液相色譜-串聯(lián)線性離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)AB公司)，配Waters超高效液相色譜儀和電噴霧離子源；T18渦旋混勻器(德國(guó)IKA公司);8210 型水浴超聲波裝置(日本Yamato公司)；日立5810型離心機(jī)（日本hitachi 公司）；OA-SYS 氮?dú)鉂饪s儀 (美國(guó)Organomation公司)。草酸孔雀石綠(malachite green，MG)、隱性孔雀石綠(1eucomalaehite green，LMG)標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥91%，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司，50 μg/mL孔雀石綠同位素內(nèi)標(biāo)（MG-D5）和50 μg/mL隱性孔雀石綠同位素內(nèi)標(biāo)（LMG-D6）標(biāo)準(zhǔn)溶液均購(gòu)于農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究中心。C18鍵合相填料粉(美國(guó)Agilent公司)；甲酸(96%)、乙酸銨和乙腈(色譜純,美國(guó)Fisher公司)；中性氧化鋁（天津科密歐公司，100目～200目），其它試劑均為分析純；水為Millipore純水系統(tǒng)制得高純水(≥18MΩ/cm)。

表1 孔雀石綠及其代謝物質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters of MG and LMG Compounds Parent ions Product ions Chemical Formula CE(V)CXP(V)

2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別稱(chēng)取按質(zhì)量折算為100%純度的標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于100 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并定容至刻度，該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液濃度為100 μg/mL，-18℃以下保存，有效期為6個(gè)月。取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈配制成質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL中間標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，2℃～4℃保存，有效期為1個(gè)月。取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈-0.1%甲酸(1+1,V/V)稀釋質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的質(zhì)譜調(diào)諧溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。取適量的MG-D5和LMG-D6內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液用乙腈逐級(jí)稀釋?zhuān)频肕G-D5 25 ng/mL、LMG-D6 100 ng/mL的混合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，2℃～4℃保存，有效期為1個(gè)月。

2.3 儀器條件

色譜柱：CAPCELL PAK MGⅡ (150 mm 2.1 mm id,5 μm)；柱溫:30 ℃；流動(dòng)相A：乙腈，B:0.1%甲酸溶液；洗脫梯度程序：0 min(80%A)，保持0.5 min；0.5 min～2.5 min(40%A)；2.5 min～4.0 min(5%A)保持2 min；6.0 min～6.1 min(80%A)，保持4 min 流速：0.3 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL。

電噴霧離子化方式下正離子電離(ESI+)；霧化氣：379 kPa(55 psi)；氣簾氣:241 kPa(35 psi)；噴霧電壓：5500 V；去溶劑溫度：550 ℃；去溶劑氣：379 kPa(55 psi)；碰撞氣：69 kPa(8 psi)；離子對(duì)駐留時(shí)間：60 ms；去簇電壓(DP)：120 V，射入電壓(EP)：10 V，碰撞能量(CE)、碰撞室出口電壓(CXP)和其它質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

2.4 樣品前處理

稱(chēng)取5.0 g樣品置于50 mL離心管中，加入100 μL混合內(nèi)標(biāo)溶液，加入0.5 g抗壞血酸、1 mL0.1 mol/L乙酸銨溶液、20 mL乙腈，渦旋混勻3 min，常溫水浴超聲10 min，取出加入2.0 g氯化鈉、0.5 g C18粉，渦旋混勻3 min，靜置5 min確保樣液充分與填料接觸，以4000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清液于另一離心管中，再加入5 g中性氧化鋁粉，渦旋混勻3 min，靜置5 min確保樣液充分與填料接觸，以4000 r/min離心2 min，取4 mL上清液氮吹濃縮至0.3 mL左右，用0.1%甲酸定容至1 mL，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，供HPLC-MS/MS測(cè)定(實(shí)驗(yàn)需要在避光下操作)。

3 結(jié)果與討論

3.1 樣品提取條件的選擇

極性物質(zhì)孔雀石綠在三文魚(yú)體中很快代謝為弱極性隱性孔雀石綠，孔雀石綠的殘留以孔雀石綠及其代謝物的總和計(jì)算。兩種分析物的化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，易發(fā)生去甲基化和氧化降解反應(yīng)，提取時(shí)需要加入還原劑防止降解。對(duì)比了添加抗壞血酸和未添加的效果，結(jié)果表明添加，樣品中添加抗壞血酸后回收率提高20%，所以本方法提取時(shí)加入抗壞血酸還原劑。為兼顧孔雀石綠易溶于水和極性有機(jī)溶劑、隱色孔雀石綠易溶于有機(jī)溶劑的特性，對(duì)比了甲醇、乙腈兩種有機(jī)溶劑的提取效果，結(jié)果表明乙腈提取時(shí)共萃物少，最終選擇將乙腈作為提取溶劑。

3.2 提取環(huán)境的優(yōu)化

孔雀石綠及其代謝物屬光、熱和氧氣敏感物質(zhì)，易產(chǎn)生降解物。試驗(yàn)對(duì)比了兩種操作條件下的實(shí)驗(yàn)效果：A光照+60℃水浴超聲環(huán)境，B避光+常溫超聲。A條件下兩種分析物的平均回收率45.7%，B條件下兩種分析物的平均回收率76.3%，最終實(shí)驗(yàn)選擇在避光、常溫水浴條件下進(jìn)行操作。

3.3 凈化方法的選擇

三文魚(yú)中約含8%脂肪，在進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)定前需要采用合適的凈化方法去除基質(zhì)脂肪及其它干擾物。試驗(yàn)了正己烷液液萃取、C18粉+氯化鈉鹽析法、C18粉+氯化鈉鹽析法+中性氧化鋁凈固相分散法的萃取效果，結(jié)果如圖1所示，在正己烷液液萃到過(guò)程中，親脂性LMG部分轉(zhuǎn)移至正己烷層，導(dǎo)致LMG回收率下降34.1%。C18粉和中性氧化鋁聯(lián)合前處理方法，可去除樣品中芳香族和脂肪族的干擾物質(zhì)，回收率高，有效降低了基質(zhì)效應(yīng)。

圖1 在不同凈化條件下的測(cè)定三文魚(yú)的結(jié)果Fig.1 Analysis results of salmon sample in the different purification conditions

3.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

由于孔雀石綠及其代謝物結(jié)構(gòu)中存在易電離的氨基，采用0.5 μg/mL的質(zhì)譜調(diào)諧溶液在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描時(shí)，結(jié)果顯示化合物獲得信號(hào)強(qiáng)度較高的[M+H]+分子離子峰。以[M+H]+為母離子,進(jìn)行子離子全掃描，孔雀石綠及其代謝物碎片裂解主要是由脫甲基、苯環(huán)斷裂形成（見(jiàn)表1），根據(jù)2002/657/EEC關(guān)于確證法4個(gè)確證點(diǎn)的要求，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩對(duì)子離子進(jìn)行檢測(cè)，并優(yōu)化DP、CE、EP、CXP、電噴霧電壓、離子源溫度、霧化氣和氣簾氣等參數(shù)，獲得2.3節(jié)所述的質(zhì)譜參數(shù)。

3.5 穩(wěn)定性測(cè)試

為了測(cè)定孔雀石綠及其代謝物的穩(wěn)定性，分別將濃度為100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液、1 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)工作溶液、10 ng/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在室溫、2℃～4℃和≤-18℃儲(chǔ)存條件下的進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)試。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明不同儲(chǔ)存條件影響MG和LMG的穩(wěn)定性，在≤-18℃條件下儲(chǔ)存，100 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液6個(gè)月內(nèi)未出現(xiàn)降解，1 μg/mL1個(gè)月內(nèi)響應(yīng)值未發(fā)生變化，10 ng/mL基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在室溫下12小時(shí)后發(fā)生降解，2℃～4℃下24小時(shí)發(fā)生降解。

3.6 線性范圍和方法檢測(cè)限

陰樣品基質(zhì)溶液配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液濃度為0.2 μg/kg、0.5 μg/kg、1.0 μg/kg、5.0 μg/kg、20.0 μg/kg，分別以定量離子對(duì)與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比(縱坐標(biāo)Y)對(duì)濃度(橫坐標(biāo)X)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，線性方程分別為Y=1.47X+0.0884（相關(guān)系數(shù)r=0.9996）和Y=0.67X-0.0822（相關(guān)系數(shù)r=0.9980）。以信噪比(S/N)≥3確定方法定性檢出限(LOD)，以(S/N)≥10為方法定量檢測(cè)限(LOQ)，經(jīng)計(jì)算：孔雀石綠及其代謝物L(fēng)OD為0.1 μg/kg，LOQ為0.5 μg/kg。

3.7 回收率和精密度

取陰性三文魚(yú)樣品添加3個(gè)水平標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(1×LOQ、2×LOQ、4×LOQ)進(jìn)行回收率試驗(yàn)。每個(gè)添加水平平行測(cè)定10次，MG方法回收率范圍及RSD為87.6%～105.7%（4.7%～7.5%），LMG方法回收率范圍及RSD為91.4%～102.8%（3.3%～6.8%），陰性樣品添加回收色譜圖見(jiàn)圖2。

圖2 陰性樣品添加0.5μg/kg回收選擇離子流色譜圖Fig.2 The MRM chromatograms of spiked 0.5 μg/kg negative salmon sample

4 結(jié)論

建立了一種同時(shí)定量與定性測(cè)定冰鮮三文魚(yú)中孔雀石綠及其代謝物總殘量的分析方法，方法的各項(xiàng)參數(shù)經(jīng)驗(yàn)證后均符合相關(guān)法規(guī)要求。根據(jù)孔雀石綠及其代謝物特殊的物理化學(xué)性質(zhì)，方法采用分散固相萃取法凈化，在進(jìn)行測(cè)定時(shí)三文魚(yú)樣品基質(zhì)影響小，內(nèi)標(biāo)法定量準(zhǔn)確，可以作為我國(guó)進(jìn)口冰鮮三文魚(yú)的確證方法。