劉真真，李 榮,*，湯書(shū)華，黃賢勇，張萬(wàn)晶，李勇杰，姜子濤,2,*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津天獅學(xué)院食品工程學(xué)院，天津 301700）

TiO2作為一種新型的分離分析材料，具有機(jī)械強(qiáng)度高、酸堿穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[1]，對(duì)堿性化合物沒(méi)有不可逆吸附[2-3]，且對(duì)磷酸肽等具有較好的選擇吸附作用[4]，在分離分析中具有良好的應(yīng)用前景，但是比表面積小、孔徑分布不均和孔徑小等方面的缺點(diǎn)大大限制了作為介孔材料的TiO2在色譜填料以及固相萃取（solid phase extraction，SPE）方面的應(yīng)用[5]。將TiO2與具有大比表面積的材料復(fù)合是改善其比表面積的有效途徑，層層自組裝法（layer-by-layer，LBL）便是其中的方法之一[6-7]。LBL是利用靜電作用力將電負(fù)性不同的帶電粒子進(jìn)行結(jié)合。研究結(jié)果表明，通過(guò)LBL合成的核殼型復(fù)合材料在生物工程學(xué)[8]、電磁信息轉(zhuǎn)化[9]以及表面工程[10]等方面應(yīng)用廣泛，在SPE方面的應(yīng)用還有待拓展。

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptides，CPPs）是一種經(jīng)單一或復(fù)合蛋白酶水解牛乳酪蛋白得到的含有磷酸絲氨酸基團(tuán)的生物活性多肽[11-12]。在堿性條件下，CPPs可防止鈣、鐵等離子的沉淀，從而促進(jìn)其吸收，因此CPPs被稱為“礦物質(zhì)載體”[13-16]?，F(xiàn)今已有報(bào)道的關(guān)于CPPs富集的方法主要包括：免疫沉淀法、固定金屬離子親和色譜法、金屬氧化物親和色譜法[17]及強(qiáng)陰陽(yáng)離子交換色譜法[18]。免疫沉淀法由于成本高，對(duì)于分子質(zhì)量低的磷酸化絲氨酸和蘇氨酸并不適用，目前多應(yīng)用于從小規(guī)模的細(xì)胞提取物中進(jìn)行酪氨酸磷酸蛋白的富集[19]。固定金屬離子親和色譜法是通過(guò)帶正電的金屬離子與帶負(fù)電的磷酸基團(tuán)產(chǎn)生靜電交互作用而結(jié)合來(lái)富集磷酸肽，但這種結(jié)合能力在高pH值或磷酸鹽存在的緩沖液中會(huì)被破壞，磷酸化肽會(huì)被釋放出來(lái)[20]。強(qiáng)陰陽(yáng)離子交換色譜法因其對(duì)樣品需求量大、工作量大而應(yīng)用受限[21]。金屬氧化物親和色譜法不僅可以快速、高效地富集磷酸肽，而且其金屬氧化物（如TiO2）大多具有很好的化學(xué)穩(wěn)定性，故而廣泛應(yīng)用于磷酸肽富集研究，發(fā)展迅速[22]。

本研究利用LBL技術(shù)，合成了具有高比表面積、多孔結(jié)構(gòu)的SiO2@TiO2核殼型復(fù)合材料，并用于樣品中CPPs的分離富集。通過(guò)高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜（liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，LC-Q-TOF-MS）等手段對(duì)CPPs進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，采用內(nèi)標(biāo)法對(duì)CPPs進(jìn)行定量分析。本研究旨在為食品、藥品中CPPs（特別是低豐度）成分的分離分析提供一個(gè)行之有效的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氨糖軟骨素鈣片和嬰兒配方奶粉樣品，購(gòu)自于天津市內(nèi)大型購(gòu)物超市。

CPPs樣品 天津百奧泰科技發(fā)展有限公司；甲醇、乙腈（色譜純） 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；SiO2填料（Davisil硅膠，粒徑16～24 μm，孔徑15 nm，比表面積289 m2/g） 美國(guó)格雷斯公司；異丙氧基鈦（Ti(OPri)4）安徽省泰昌化工試劑有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium lauryl sulfate，SDS）、氨水、氫氧化鈉、鹽酸天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；氟化銨 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

6520 Q-TOF-MS、1200系列HPLC儀 美國(guó)Agilent公司；JEOL場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）（配有電子能譜（energy dispersive spectrometry，EDS）附件） 日本電子株式會(huì)社；HGC數(shù)控SPE儀 上海禾工科學(xué)儀器有限公司；F-Sorb 3400全自動(dòng)比表面積及孔徑測(cè)試儀 北京金埃譜科技有限公司；TSX1200紫外分光光度計(jì) 西尼特（北京）有限公司；H2050R-1醫(yī)用離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SiO2@TiO2復(fù)合材料的制備及表征

SiO2@TiO2復(fù)合材料參照文獻(xiàn)[23-26]的方法制備并適當(dāng)改進(jìn)，具體制備流程如下：

1）SiO2的活化：稱取2 g的SiO2填料放于100 mL三角瓶中，按照10 mL/g的比例向其中加入1 mol/L HCl溶液，45 ℃超聲30 min后轉(zhuǎn)移至恒溫振蕩器中，45 ℃恒溫振蕩12 h，然后進(jìn)行抽濾，沉淀用去離子水洗至中性，80 ℃真空干燥4 h，冷至室溫，即得到活化后的SiO2；2）有機(jī)分子膜組裝：將活化后的SiO2浸入到100 mL濃度為0.05 mol/L的SDS溶液中，超聲30 min，抽濾、蒸餾水洗滌，除去未吸附的SDS，80 ℃真空干燥5 h后冷至室溫，得到SiO2@SDS；3）TiO2的組裝：將SiO2@SDS浸入TiO2溶膠中（該溶膠按照文獻(xiàn)[2]的方法制得），在溫度為15 ℃條件下，恒溫磁力攪拌3 h，靜置陳化12 h，離心去除上清液，用無(wú)水乙醇洗滌3 次，80 ℃真空干燥5 h后冷至室溫，得到SiO2@SDS@TiO2復(fù)合材料；4）多層復(fù)合材料組裝：將步驟3）中得到的SiO2@SDS@TiO2復(fù)合材料浸入到100 mL 0.05 mol/L SDS溶液中，之后重復(fù)步驟2）、3）的操作，即可制備包覆多層的SiO2/SDS/TiO2復(fù)合材料；5）SiO2@SDS@TiO2復(fù)合材料煅燒：將所制備SiO2@SDS@TiO2復(fù)合材料置于馬弗爐中煅燒，以0.5 ℃/min升溫速率升溫至350 ℃并維持3 h，除去復(fù)合材料中的有機(jī)物，即可制備出SiO2@TiO2復(fù)合材料。

通過(guò)改變TiO2溶膠與SiO2的比例、陳化時(shí)間、包覆層數(shù)和煅燒溫度等的單因素試驗(yàn)，確定采用LBL法制備SiO2@TiO2核殼型復(fù)合材料的最佳條件。對(duì)所制備的SiO2@TiO2復(fù)合材料，采用SEM、EDS進(jìn)行表征，并利用氮吸附-脫附法（Brunauer-Emmett-Teller，BET）測(cè)定所制備的SiO2@TiO2復(fù)合材料的比表面積及孔徑。

1.3.2 SiO2@TiO2復(fù)合材料SPE柱的制備與對(duì)CPPs的富集

1.3.2.1 配制1.0 mg/mL的CPPs樣品液

稱取0.100 0 g CPPs樣品粉末置于燒杯中，加1.5 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，在超聲條件下使之溶解，然后將溶液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，超純水定容至刻度。

1.3.2.2 SPE柱填裝及預(yù)處理

首先在SPE柱底端裝入聚丙烯篩板，再稱取2.0 g的SiO2@TiO2復(fù)合材料填裝于3 mL SPE柱內(nèi)，之后在SPE柱頂部裝入聚丙烯篩板。接著將SPE柱安裝在數(shù)控SPE儀上，對(duì)SiO2@TiO2復(fù)合材料進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的具體方法為：先用0.1 mol/L的NaOH溶液對(duì)SPE柱進(jìn)行淋洗，并用超純水洗滌至中性；然后用0.1 mol/L HCl溶液對(duì)SPE柱進(jìn)行淋洗，再用超純水洗滌至中性；最后用甲醇淋洗。以上活化過(guò)程均在0.5 mL/min流速下進(jìn)行。

1.3.2.3 CPPs的富集

將SPE儀的流速設(shè)定為0.2 mL/min。向SPE柱中加入1.0 mg/mL的CPPs溶液，收集24 min（約2 倍柱床體積）流出液并標(biāo)記；然后用超純水淋洗SPE柱，收集淋洗液并標(biāo)記，再用0.3 mol/L的氨水進(jìn)行洗脫，收集24 min洗脫液并標(biāo)記，并將流出液、淋洗液及洗脫液于冰箱中4 ℃保存，在進(jìn)行HPLC和LC-Q-TOF-MS分析之前，需經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾。

1.3.3 CPPs吸附率及解吸率的測(cè)定

將1.3.2.3節(jié)得到CPPs樣品液原液、流出液及洗脫液進(jìn)行HPLC分析，HPLC條件參照文獻(xiàn)[27]并加以改進(jìn)，流動(dòng)相為甲醇、20 mmol/L氟化銨體積比7∶93；柱溫為45 ℃；等度洗脫，流速為0.8 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；色譜柱為Vydac 218TP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

利用原液中CPPs的峰面積與質(zhì)量濃度之比等于洗脫液中CPPs的峰面積與質(zhì)量濃度之比，求出洗脫液中CPPs的質(zhì)量濃度，以此類推可分別計(jì)算出流出液、洗脫液中CPPs的質(zhì)量濃度，再按公式（1）、（2）求算出SPE柱對(duì)CPPs的吸附率與解吸率。

式中：E表示吸附率；ρ1、ρ2、ρ3分別表示樣品液、流出液、洗脫液中的CPPs質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V1、V2、V3分別表示樣品液、流出液、洗脫液的上樣體積/mL；D表示解吸率。

1.3.4 LC-Q-TOF-MS對(duì)富集后的CPPs結(jié)構(gòu)的分析鑒定

LC條件：Vydac 218TP C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)15%乙腈水溶液，采用等度洗脫的方式進(jìn)行；柱溫45 ℃；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣量5 μL。MS條件：電噴霧離子源；正離子模式；離子源溫度：350 ℃；霧化氣流速：10 L/min；噴霧器壓力：30 psig；電壓：175 V；透鏡：65 V；離子噴霧電壓：4 000 V；一級(jí)MS質(zhì)荷比范圍：m/z 60～3 200；二級(jí)MS碰撞能量數(shù)據(jù)設(shè)置見(jiàn)表1；檢測(cè)范圍：m/z 50～3 000；母離子優(yōu)選價(jià)態(tài)：2、3、大于3。所得信息利用Mascot軟件進(jìn)行檢索，鑒定匹配肽鏈中的氨基酸鏈接順序。

表1 二級(jí)MS碰撞能量設(shè)置Table 1 Collision energy setting of tandem mass spectrometry

1.3.5 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定樣品中CPPs的含量

1.3.5.1 內(nèi)標(biāo)工作曲線的制作

采用內(nèi)標(biāo)法測(cè)定CPPs的含量，選擇茶堿作為內(nèi)標(biāo)物。配制1.0 mg/mL茶堿標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制SiO2@TiO2復(fù)合材料填裝的SPE柱富集后得到茶堿的洗脫液，將洗脫液分別稀釋50、100、200、300、400、500 倍體積，得到一系列質(zhì)量濃度的茶堿標(biāo)準(zhǔn)液。再取1.0 mg/mL CPPs樣品洗脫液分別加入到1.0 mL一系列質(zhì)量濃度的茶堿標(biāo)準(zhǔn)液中，混合，過(guò)0.45 μm的濾膜，然后進(jìn)行HPLC分析。據(jù)公式（3）計(jì)算出不同稀釋倍數(shù)的茶堿洗脫液中茶堿的質(zhì)量，以茶堿質(zhì)量為橫坐標(biāo)，以茶堿與CPPs的峰面積之比為縱坐標(biāo)，得到內(nèi)標(biāo)工作曲線。

式中：m表示茶堿的質(zhì)量/μg；ρ表示茶堿的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V表示加入的茶堿的體積/mL；E表示SPE柱的吸附率/%；D表示SPE柱的解吸率/%；n表示稀釋倍數(shù)。

1.3.5.2 樣品前處理

對(duì)于CPPs樣品，依照1.3.2.1節(jié)的方法制成1.0 mg/mL的樣品溶液。對(duì)于鈣片和奶粉樣品，前者需用研缽研磨成約40 目的粉末，后者可直接使用。分別稱取0.500 0 g粉碎后的鈣片或奶粉樣品，加適量0.1 mol/L NaOH超聲溶解，然后加入超純水后繼續(xù)超聲10 min，抽濾后取濾液進(jìn)行離心，將上清液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，超純水定容并搖勻，得到5.0 mg/mL鈣片及奶粉的樣品溶液。依照1.3.2.3節(jié)的方法將配制好的樣品液上樣，富集其中的CPPs，再按1.3.3節(jié)的HPLC條件將樣品富集前的原液及富集后的洗脫液分別進(jìn)樣。

1.3.5.3 CPPs成分含量的測(cè)定

采用文獻(xiàn)[28]的方法，并據(jù)公式（4）計(jì)算CPPs的質(zhì)量，據(jù)公式（5）計(jì)算出樣品中CPPs的含量。

式中：ms表示洗脫液中CPPs成分的質(zhì)量/μg；mi表示茶堿的質(zhì)量/μg；fs表示洗脫液中CPPs的絕對(duì)校正因子；As表示洗脫液中CPPs的峰面積；fi表示茶堿的絕對(duì)校正因子；Ai表示茶堿的峰面積；ω表示樣品中CPPs的含量/（μg/mg）；ρ樣表示上樣液的質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V樣表示上樣液的體積/mL；E表示SPE柱的吸附率/%；D表示SPE柱的解吸率/%。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 16.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Origin 8.5軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiO2@TiO2復(fù)合材料的表征

2.1.1 SiO2@TiO2復(fù)合材料的SEM和EDS表征

從圖1可以看出，內(nèi)核材料SiO2在包覆前表面是光滑的，當(dāng)TiO2納米粒子沉積在其表面即被包覆后，SiO2表面變得粗糙，且隨著包覆層數(shù)的增加，SiO2表面沉積的TiO2粒子逐漸增多，表面的粗糙程度也越大；當(dāng)包覆層數(shù)達(dá)到8 層時(shí)，SiO2表面基本全部覆蓋了TiO2粒子，之后再增加包覆層，表面變化不明顯。

由圖2可知，包覆層數(shù)由0 層增加到8 層時(shí)，硅元素的原子百分比從34.55%降至11.99%，鈦元素的原子百分比從0%升至19.25%；當(dāng)包覆層數(shù)由8 層增加到9 層時(shí)，硅元素的原子百分比從11.99%降至10.12%，鈦元素的原子百分比從19.25%升至20.88%，變化趨于平穩(wěn)。結(jié)合圖1、2的結(jié)果可以證明包覆層數(shù)為8 層時(shí)包覆達(dá)到飽和。

圖1 不同包覆層數(shù)的SiO2@TiO2復(fù)合材料的SEM圖Fig. 1 Scanning electron microscope images of SiO2@TiO2 composite with different layers of TiO2 coating

圖2 不同包覆層數(shù)的SiO2@TiO2復(fù)合材料的EDS分析結(jié)果Fig. 2 EDS images of SiO2@TiO2 composite with different layers of TiO2 coating

2.1.2 SiO2@TiO2復(fù)合材料的比表面積及孔徑分析

用BET法對(duì)包覆8 層合成的SiO2@TiO2復(fù)合材料的比表面積及孔徑進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖3。運(yùn)用BET法測(cè)得的SiO2@TiO2復(fù)合材料比表面積為116.26 m2/g。根據(jù)SiO2@TiO2復(fù)合材料的BET等溫線（圖3A），結(jié)合BDDT吸附等溫線理論可知，該材料的吸附特征及出現(xiàn)的毛細(xì)管凝結(jié)的現(xiàn)象均符合中孔結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，從而說(shuō)明了SiO2@TiO2復(fù)合材料具有多孔結(jié)構(gòu)。從孔徑分布（圖3B）可以看出，SiO2@TiO2復(fù)合材料的孔徑主要分布在2～13 nm范圍內(nèi)，平均孔直徑為8.42 nm，分布較窄并且均勻。

圖3 SiO2@TiO2復(fù)合材料的BET等溫線（A）和孔徑分布（B）Fig. 3 Nitrogen adsorption/desorption isotherms (A) and pore size distribution (B) of SiO2@TiO2 composite

2.2 SiO2@TiO2復(fù)合材料對(duì)CPPs的富集

圖4 CPPs樣品富集前后的分析Fig. 4 Comparative elution profiles of original and enriched CPPs

由圖4可知，流出液保留時(shí)間大于5 min時(shí)，沒(méi)有明顯的色譜峰出現(xiàn)，表明富集之后，樣品中的CPPs基本被SiO2@TiO2復(fù)合材料吸附；而洗脫液保留時(shí)間在5 min之后的色譜峰響應(yīng)值較原液增大了1～2 倍，SPE柱對(duì)CPPs的吸附率為93.0%，解吸率為81.5%，說(shuō)明SiO2@TiO2復(fù)合材料對(duì)CPPs有較好的富集效果。

2.3 利用LC-Q-TOF-MS法鑒定CPPs的結(jié)構(gòu)

從圖5可以看出，所測(cè)定的CPPs樣品液有5 個(gè)信號(hào)較高的色譜峰，此說(shuō)明CPPs樣品主要是由這5 種化合物構(gòu)成的。

利用LC-Q-TOF-MS法對(duì)CPPs的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。在MS分析過(guò)程中，磷酸肽的穩(wěn)定性比較差，由于碰撞誘導(dǎo)裂解，磷酸肽中性磷酸（如H3PO4、HPO3）易丟失[29-30]。其中，磷酸化的Ser和Thr易發(fā)生β消除，即丟失H3PO4分子，分子質(zhì)量減小98 Da[31]。結(jié)合得到的離子碎片圖和Mascot檢索的結(jié)果，分析確定了洗脫液中的5 種CPPs，據(jù)總離子流圖提取出每種CPPs對(duì)應(yīng)的質(zhì)核比以及每個(gè)質(zhì)核比對(duì)應(yīng)的二級(jí)MS碎片等具體參數(shù)（表2），各CPPs對(duì)應(yīng)的斷裂結(jié)構(gòu)解析如圖6所示，說(shuō)明洗脫液中的5 個(gè)峰均為磷酸肽，可見(jiàn)SiO2@TiO2復(fù)合材料對(duì)CPPs具有非常好的富集作用。

圖5 洗脫液總離子流圖Fig. 5 Total ion current chromatogram of the eluent

表2 主要的CPPsTable 2 Major components of CPPs

圖6 CPPs的斷裂結(jié)構(gòu)解析Fig. 6 Fragmentation of CPPs

2.4 SiO2@TiO2復(fù)合材料富集CPPs的應(yīng)用

2.4.1 工作曲線的制作

茶堿與5 種CPPs的工作曲線如圖7所示，據(jù)工作曲線可以得出茶堿與每種CPPs對(duì)應(yīng)的線性方程、決定系數(shù)R2以及相對(duì)校正因子（即組分與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的絕對(duì)校正因子之比），如表3所示。

圖7 內(nèi)標(biāo)工作曲線Fig. 7 Internal standard working curves

表3 內(nèi)標(biāo)工作曲線線性方程及相關(guān)參數(shù)Table 3 Linear equations with correlation coefficients and relative correction factors from internal standard working curves

2.4.2 樣品的測(cè)定及加標(biāo)回收率

由圖8A可以看出，CPPs樣品洗脫液在5 min后出現(xiàn)5 個(gè)響應(yīng)值明顯大于CPPs原液的峰，結(jié)合LC-Q-TOF-MS的結(jié)果可知，圖8A中這5 個(gè)峰均為CPPs。由圖8B可知，鈣片樣品洗脫液在保留時(shí)間分別為7.4 min和10.8 min時(shí)色譜峰響應(yīng)值均明顯大于鈣片樣品原液的色譜峰，這兩個(gè)時(shí)間分別對(duì)應(yīng)PHS*、PS*SRS*EP的保留時(shí)間，可以得出保留時(shí)間在7.4 min和10.8 min的成分均是鈣片中的CPPs。由圖8C可知，奶粉樣品洗脫液在保留時(shí)間為7.4 min時(shí)色譜峰響應(yīng)值大于奶粉樣品原液，且與PHS*的保留時(shí)間一致，可以得出保留時(shí)間在7.4 min的成分是奶粉中的CPPs成分。圖8中14.3 min處均為茶堿富集前后的色譜峰。

圖8 樣品富集前后的分析Fig. 8 Chromatograms of original and enriched CPPs from real samples

加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表4所示。CPPs樣品、氨糖軟骨素鈣片和嬰兒配方奶粉中CPPs的含量分別為2 676.3、174.6、38.7 mg/100 g，平均加標(biāo)回收率分別為95.1%、94.4%和92.5%。加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，用茶堿作內(nèi)標(biāo)測(cè)定樣品中CPPs含量的方法有良好的精密度和準(zhǔn)確度。

表4 樣品中茶堿加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 Recoveries of CPPs from real samples spiked at different levels with the internal standard theophylline

3 結(jié) 論

本研究采用LBL法制備出了性能優(yōu)良的SiO2@TiO2核殼型復(fù)合材料，在利用SiO2@TiO2復(fù)合材料填充的SPE柱富集磷酸肽的基礎(chǔ)上，通過(guò)HPLC分析得到其對(duì)CPPs的吸附率為93.0%，解吸率為81.5%；又通過(guò)二級(jí)MS確定了CPPs樣品洗脫液中的5 種磷酸肽成分，分別為PS*H、PS*PR、S*SRS*E、PHS*、PS*SRS*EP；同時(shí)建立了以茶堿為內(nèi)標(biāo)測(cè)定樣品中CPPs含量的方法，結(jié)果表明制備的SiO2@TiO2復(fù)合材料對(duì)CPPs具有較理想的富集效果，內(nèi)標(biāo)法測(cè)定樣品中CPPs的含量方法可靠。