何萍萍，韋敬柳乙，姜澤東,2,3,4,*，朱艷冰,2,3,4，倪 輝,2,3,4，李清彪,2,3,4

（1.集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021；2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021；3.廈門南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用與深加工重點實驗室，福建 廈門 361021；4.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021）

泡葉藻（Ascophyllum nodosum）是生長在潮間帶的大型海洋褐藻，分布廣泛，易于收獲[1]。泡葉藻用途較為廣泛，除了工業(yè)上用于大規(guī)模生產(chǎn)褐藻膠、甘露醇和碘外，還被廣泛應(yīng)用于制備食品營養(yǎng)補(bǔ)充劑、飼料和肥料等[2]。泡葉藻除了富含大量的褐藻膠外，泡葉藻聚糖（ascophyllan，As）和巖藻聚糖也是泡葉藻藻體中主要的多糖組成成分，分別約占藻體總糖的13%和8%[3]。As是挪威學(xué)者Larsen等[4]從泡葉藻中分離出的區(qū)別于褐藻膠和巖藻聚糖的一種多糖硫酸酯，其主要化學(xué)組成為：巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）（約25%）、木糖（xylose，Xyl）（約26%）、糖醛酸（約19%）、硫酸基團(tuán)（約13%）、蛋白質(zhì)（約12%）等[5]。通過研究泡葉藻多糖的部分酸水解片段，推測As的主鏈主要由β-D-甘露糖醛酸通過1,4-糖苷鍵鏈接構(gòu)成，支鏈主要由Fuc、Xyl和硫酸基團(tuán)組成[6-8]。近年來的研究指出，泡葉藻多糖具有多種優(yōu)良的生物活性，如免疫誘導(dǎo)[9-12]、抗氧化[13-14]、抗腫瘤[15-16]、抗炎[17]活性等，使其在功能食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域有一定的開發(fā)和應(yīng)用前景。

天然As具有多種有益的生物活性，但其單糖組成較復(fù)雜且分子質(zhì)量（390 kDa）較大[18]，限制了對其精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析和構(gòu)效關(guān)系的研究，這也是海藻多糖開發(fā)應(yīng)用中的基礎(chǔ)科學(xué)問題之一。另外，高分子天然海藻多糖的生物利用度較低，這從另一方面限制了其在食品領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用。近年來相關(guān)研究表明，將高分子質(zhì)量的海藻多糖降解成低分子質(zhì)量的多糖或寡糖可有效保留原有的活性或產(chǎn)生新的活性[19-23]，同時也使其更容易被機(jī)體吸收，提高生物利用度[22]。因此，對天然As進(jìn)行有效降解，制備其高活性的低分子質(zhì)量降解片段，分析其基本組成特征，可有效解決限制其在食品領(lǐng)域進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用的關(guān)鍵科學(xué)問題，也可為其精細(xì)結(jié)構(gòu)的解析和構(gòu)效關(guān)系的研究提供科學(xué)依據(jù)。目前，關(guān)于As降解的研究以及降解產(chǎn)物中低分子質(zhì)量多糖的組成特征和生物活性尚鮮有報道。本研究利用經(jīng)典的多糖酸水解法和氧化降解法制備As降解產(chǎn)物，通過超濾法結(jié)合凝膠過濾柱層析法對降解產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化，獲得不同的As低分子質(zhì)量降解片段，分析其基本組成特征，并利用小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7分析其體外免疫誘導(dǎo)活性，為As低分子質(zhì)量降解片段的制備提供理論依據(jù)，也為As在食品領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

泡葉藻 青島明月海藻集團(tuán)；RAW264.7細(xì)胞中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海）；Sephadex G-50葡聚糖凝膠 瑞典GE公司；纖維素酶（來源于黑曲霉（Aspergillus niger））、牛血清白蛋白、葡聚糖分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品、單糖標(biāo)準(zhǔn)品（包括Fuc、Xyl、D-半乳糖（galactose，Gal）、D-甘露糖（mannose，Man）、D-葡萄糖（glucose，Glc）） 美國Sigma-Aldrich公司；對氨基苯甲酸乙酯（ethyl-p-aminobenzoate，ABEE）（純度≥98.0%） 日本和光純藥工業(yè)株式會社；Mouse TNF-α Colorimetric ELISA kit 艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司；超濾膜（10 kDa分子質(zhì)量截留） 中國安得膜分離技術(shù)工程（北京）有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J26XP高速冷凍離心機(jī) 德國貝克曼公司；Free Zone 6 plus真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco公司；PUMP 1525高效液相色譜儀 美國沃特世公司；TSK gel G4000 PWXL液相色譜分析柱 日本東曹株式會社；BioTek Cytation-5細(xì)胞成像多功能檢測系統(tǒng) 美國伯騰儀器有限公司；1360 Infinity超高壓高效液相色譜儀（配有可變波長紫外檢測器） 美國安捷倫科技有限公司；GlyScope Honenpak C18色譜柱 日本J-Oil Mills株式會社；iS50 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀 美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 As的提取

泡葉藻經(jīng)洗凈、干燥、粉碎后，過60 目標(biāo)準(zhǔn)篩，按質(zhì)量比1:30將泡葉藻粉與水混勻，加入200 U/mL纖維素酶，于50 ℃水浴中酶解2 h。酶解結(jié)束后置于100 ℃水浴浸提2 h，冷卻至室溫，5 000×g離心20 min除去藻渣。抽提上清液用HCl溶液調(diào)至pH 1.3，于4 ℃下過夜放置，10 000×g冷凍離心20 min，去除褐藻膠沉淀。上清液用NaOH溶液調(diào)至中性后于4 ℃下用體積分?jǐn)?shù)50%乙醇沉淀過夜，冷凍離心后收集沉淀，用適量蒸餾水復(fù)溶，經(jīng)3 500 Da分子質(zhì)量截留的透析袋透析48 h后冷凍干燥獲得As[24]。

1.3.2 As低分子質(zhì)量降解產(chǎn)物的制備

1.3.2.1 酸水解法制備低分子質(zhì)量降解產(chǎn)物

采用1.0 mol/L HCl將As配成25.0 mg/mL多糖溶液，置于80 ℃水浴鍋水解4 h（體系1），冷卻至室溫后，加入過量硼氫化鈉進(jìn)行還原。降解產(chǎn)物經(jīng)0.45 μm濾膜過濾后，使用10 kDa分子質(zhì)量截留的超濾膜進(jìn)行超濾分離，收集分子質(zhì)量小于10 kDa的濾液，蒸發(fā)濃縮后，用1 000 Da分子質(zhì)量截留的透析袋純水透析48 h，冷凍干燥后得到As低分子質(zhì)量降解產(chǎn)物。

1.3.2.2 氧化降解法制備低分子質(zhì)量降解產(chǎn)物

采用體積分?jǐn)?shù)15.0% H2O2將As配成25.0 mg/mL的多糖溶液，分別置于70 ℃（體系2）和80 ℃（體系3）水浴中降解6 h，冷卻至室溫。分別參照1.3.2.1節(jié)中超濾法制備As的低分子質(zhì)量降解產(chǎn)物。

1.3.3 As低分子質(zhì)量降解片段的分離純化

分別將上述3 個體系制備的As低分子質(zhì)量降解產(chǎn)物溶于超純水，制成3.0 mg/mL多糖溶液，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，取5.0 mL上Sephadex-50凝膠層析柱（1.6 cm×100 cm），利用分子質(zhì)量不同對各降解產(chǎn)物中的低分子質(zhì)量多糖片段進(jìn)行分離純化。采用超純水進(jìn)行洗脫，控制流速為0.2 mL/min。利用自動樣品收集器按3.0 mL/管進(jìn)行收集，連續(xù)收集80 管，并采用苯酚-硫酸法[25]在490 nm波長處對吸光度（A490nm）進(jìn)行跟蹤檢測，以洗脫體積為橫坐標(biāo)，A490nm為縱坐標(biāo)作圖，繪制洗脫曲線。重復(fù)多次后，收集重復(fù)較好的洗脫峰處洗脫液，經(jīng)48 h超純水透析、冷凍干燥后獲得純化的低分子質(zhì)量降解片段。

1.3.4 As低分子質(zhì)量降解片段分子質(zhì)量的測定

采用高效分子排阻色譜法[26]測定各降解片段的重均分子質(zhì)量。分別將100 μL 2 mg/mL各樣品溶液用0.22 μm濾膜過濾除雜后，上樣于高效液相色譜儀。檢測柱為TSK gel G4000 PWXL（7.8 mm×300 mm），流動相為0.1 mol/L硫酸鈉溶液，柱溫為25 ℃，流速為1.0 mL/min。以不同重均分子質(zhì)量的葡聚糖（分別為1 270、5 220、11 600、23 800 Da和48 600 Da）作為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時間為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的重均分子質(zhì)量對數(shù)值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各降解片段的分子質(zhì)量范圍和重均分子質(zhì)量。

1.3.5 As低分子質(zhì)量降解片段的基本組成分析

1.3.5.1 低分子質(zhì)量降解片段的酸水解

用超純水將樣品配成3.0 mg/mL多糖溶液，取2.0 mL樣品溶液與2.0 mL 4.0 mol/L三氟乙酸混勻，置于100 ℃水浴中水解4 h，冷卻至室溫。然后加入4.0 mL甲醇，混勻，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將混合溶液蒸干，重復(fù)此步驟3 次。將蒸干后的水解樣品溶解于2.0 mL超純水中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 單糖組成分析

采用ABEE柱前衍生法[27]衍生單糖標(biāo)準(zhǔn)品和低分子質(zhì)量降解片段的水解產(chǎn)物。分別配制一定濃度的單糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液（Fuc、Xyl、Gal、Man、Glu），取100 μL置于具塞試管中，各加入400 μL ABEE試劑（含4.95 g ABEE、1.05 g氰基硼氫化鈉、1.23 mL冰醋酸、10.5 mL溫?zé)峒状迹?，混勻后置?0 ℃水浴中加熱1 h，取出冷卻至室溫。加2.0 mL超純水和2.0 mL三氯甲烷，漩渦混勻，靜置，棄去三氯甲烷相后重新加2.0 mL三氯甲烷，如此萃取3 次。取上層水相過0.22 μm微孔膜后進(jìn)行高效液相色譜分析[28]。低分子質(zhì)量降解片段的水解樣品同樣以上述方法進(jìn)行分析，用單糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間和峰面積分別對樣品進(jìn)行定性和定量分析。

1.3.5.3 糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

采用咔唑-硫酸法[29]，以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測定低分子質(zhì)量降解片段的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5.4 硫酸基團(tuán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分析

采用氯化鋇明膠比濁法[30]，以K2SO4為標(biāo)準(zhǔn)品，測定低分子質(zhì)量降解片段的硫酸根（）質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.6 As低分子質(zhì)量降解片段的傅里葉變換紅外光譜分析

將As低分子質(zhì)量降解片段烘干至恒質(zhì)量，與KBr充分混勻、壓片。使用iS50 FT-IR傅里葉變換紅外光譜儀，于4 000～400 cm-1范圍內(nèi)掃描，記錄As低分子質(zhì)量降解片段的傅里葉變換紅外光譜圖。

1.3.7 As低分子質(zhì)量降解片段體外免疫誘導(dǎo)活性分析1.3.7.1 RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)

RAW264.7細(xì)胞采用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1%雙抗（100 IU/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素）的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃、5.0% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.3.7.2 低分子質(zhì)量降解片段誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化釋放免疫因子NO和腫瘤壞死因子能力測定

采用Griess法[31]測定NO濃度。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞以3×104個/孔的濃度接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后，分別加入100 μL不同質(zhì)量濃度（0～200 μg/mL）的As和低分子質(zhì)量降解片段（HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1和H2O2-F2）溶液。設(shè)置DMEM培養(yǎng)基作為空白對照，于37 ℃、5.0% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，每孔取出50 μL上清液置于新96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，然后向上清液中加入100 μL Griess試劑（含3 mmol/L磺胺酸、30 mg/L N-1-(萘基)乙二胺二鹽酸鹽、質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%冰醋酸），室溫避光孵育20 min，于540 nm波長處測定OD值（OD540nm）。同時，用不同濃度的NaNO2標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算培養(yǎng)基上清液中NO濃度。

腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）質(zhì)量濃度測定采用酶聯(lián)免疫吸附法[9]。細(xì)胞接種方法參照NO濃度測定中的方法，分別用不同質(zhì)量濃度（0～200 μg/mL）的As、HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1和H2O2-F2溶液處理在37 ℃、5% CO2條件下貼壁培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞24 h后，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液將每孔取出的4 μL培養(yǎng)基上清液稀釋50 倍，然后根據(jù)Mouse TNF-α Colorimetric ELISA kit說明手冊中的操作步驟對稀釋后培養(yǎng)基上清液中TNF-α進(jìn)行定量測定。同時，根據(jù)不同質(zhì)量濃度的TNF-α標(biāo)準(zhǔn)溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算培養(yǎng)基上清液中TNF-α的質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

設(shè)置3 個平行實驗，實驗數(shù)據(jù)利用Excel 2016及Graphpad prism 5軟件處理后作圖，用SPSS 18.0軟件單因素方差分析檢驗數(shù)據(jù)差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 As低分子質(zhì)量降解片段分離純化結(jié)果

2.1.1 酸水解法降解片段分離純化結(jié)果

圖1 As酸水解法降解片段經(jīng)Sephadex G-50凝膠柱分離洗脫Fig. 1 Elution profile of low-molecular-mass fractions of hydrochloric acid degraded ascophyllan by Sephadex G-50 gel filtration chromatography

如圖1所示，得到分子質(zhì)量組成較單一的峰，表明所獲得的As低分子質(zhì)量片段已經(jīng)得到較好純化。體系1降解產(chǎn)物主峰的上升段（洗脫體積為50～150 mL）分離出一個組分，命名為HCl-F1；主峰（洗脫體積為150 mL之后的峰）命名為HCl-F2。

2.1.2 氧化法降解片段分離純化結(jié)果

圖2 As氧化法降解片段經(jīng)Sephadex G-50凝膠柱分離洗脫Fig. 2 Elution profiles of low-molecular-mass fractions of hydrogen peroxide degraded ascophyllan by Sephadex G-50 gel filtration chromatography

如圖2所示，得到組成較單一峰，表明所獲得As低分子質(zhì)量片段已經(jīng)得到較好純化。兩個體系降解產(chǎn)物都會出現(xiàn)一段緩峰，選取體系2和體系3的降解產(chǎn)物進(jìn)行Sephadex G-50凝膠柱純化，合并相同組分，由于上升段緩峰組分極少，收集困難，所以本研究以主峰為主要目標(biāo)物進(jìn)行收集。將體系2的主峰命名為H2O2-F1，將體系3的主峰命名為H2O2-F2。

2.2 As低分子質(zhì)量降解片段基本組成分析結(jié)果

As的分子質(zhì)量為390 kDa[18]。酸水解法和雙氧水氧化降解法均可有效降解As，降解產(chǎn)物經(jīng)分離和純化后獲得低分子質(zhì)量的片段HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1和H2O2-F2分子質(zhì)量分布范圍分別為3.70～7.00、3.40～8.90、4.00～7.50、1.60～4.20 kDa，重均分子量分別為4.80、4.20、5.30、2.30 kDa。由表1可知，低分子質(zhì)量降解產(chǎn)物HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1和H2O2-F2均為雜多糖；其化學(xué)組成及單糖組成表明，酸水解法降解體系和氧化法降解體系使樣品中的Fuc、Xyl、Gal、Man、硫酸根和糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)發(fā)生很大的改變。HCl-F1主要由Fuc、Xyl、Gal、Man組成，其物質(zhì)的量比為1.00:2.32:1.63:1.14；HCl-F2主要由Fuc、Xyl、Gal、Man組成，其物質(zhì)的量比為1.00:0.20:0.30:0.28；H2O2-F1主要由Fuc和Gal組成，并含有少量Xyl，不含Man，其物質(zhì)的量比為1.00:0.29:0.09；H2O2-F2主要由Fuc組成，并含有少量Xyl、Gal和Man，其物質(zhì)的量比為1.00:0.06:0.03:0.04。HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1、H2O2-F2的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為47.8%、31.3%、5.6%和27.6%，SO42-質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.3%、3.5%、12.2%和3.2%。

表1 HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1和H2O2-F2的單糖、糖醛酸和硫酸基團(tuán)組成Table 1 Monosaccharide compositions, glyconic acid and sulfation levels of HCl-F1, HCl-F2, H2O2-F1 and H2O2-F2

2.3 傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖3 As、HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1和H2O2-F2的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transform infrared spectra of As, HCl-F1, HCl-F2,H2O2-F1 and H2O2-F2

如圖3所示，雖然有一定變化，但降解前后樣品的傅里葉變換紅外光譜圖都具備了多糖類化合物特有的吸收峰。在3 400 cm-1附近的吸收峰為O—H伸縮振動峰，由于分子內(nèi)羥基間形成氫鍵而使吸收峰變寬[32]；在3 000～2 900 cm-1區(qū)較弱的吸收峰是C—H伸縮振動吸收，1 600 cm-1及1 400 cm-1附近的吸收峰分別是COO—的非對稱伸縮振動和對稱伸縮振動帶，這幾個區(qū)域的吸收峰是糖類的特征吸收峰[33]。HCl-F1、HCl-F2在1 200 cm-1附近的吸收峰很弱甚至沒有，而H2O2-F1、H2O2-F2和As在1 200 cm-1附近有較強(qiáng)的吸收峰，該吸收峰是硫酸基S=O的伸縮振動吸收[34-35]。由此表明，As酸水解法降解后硫酸基團(tuán)含量明顯減少，證明酸水解法降解過程對硫酸根的破壞作用很大，而氧化法降解前后都含有硫酸基團(tuán)，在降解過程中不存在對硫酸根的破壞，這與上述硫酸基團(tuán)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果基本一致。在1 000～1 200 cm-1附近的吸收峰分別是C—O—C、C—O—H的伸縮振動[36]，As降解前后都存在強(qiáng)吸收峰。在880 cm-1附近HCl-F1、HCl-F2都存在吸收峰，其端基碳構(gòu)型可能是β-D-吡喃糖；As在820 cm-1附近有吸收峰，其端基碳構(gòu)型可能是α-型吡喃糖；HCl-F2在550～700 cm-1附近的吸收峰是硫酸基團(tuán)的O=S=O對稱和不對稱變形振動所致[2]。

2.4 As低分子質(zhì)量降解片段的體外免疫誘導(dǎo)活性分析結(jié)果

2.4.1 低分子質(zhì)量降解片段誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化釋放NO的分析

表2 不同質(zhì)量濃度的As、HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1和H2O2-F2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化產(chǎn)生的NO濃度Table 2 NO levels in RAW264.7 cells induced by various concentrations of As, HCl-F1, HCl-F2, H2O2-F1 and H2O2-F2

表2結(jié)果表明，As、HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F2在所測定質(zhì)量濃度范圍（0～200 μg/mL）內(nèi)明顯誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化釋放NO，且RAW264.7細(xì)胞釋放NO的濃度隨著其質(zhì)量濃度增加而增加，呈質(zhì)量濃度依賴性，表明As經(jīng)過降解后獲得的低分子質(zhì)量降解片段仍可有效活化RAW264.7細(xì)胞釋放NO。HCl-F1和H2O2-F2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用比As強(qiáng)，并且存在顯著性差異；HCl-F2誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用比As弱；而H2O2-F1誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生NO的作用明顯低于HCl-F1、HCl-F2和H2O2-F2。

2.4.2 低分子質(zhì)量降解片段誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化分泌TNF-α質(zhì)量濃度

表3結(jié)果表明，在所測定的質(zhì)量濃度范圍（0～200 μg/mL）內(nèi)，As、HCl-F1、HCl-F2和H2O2-F2能明顯誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化分泌TNF-α，且呈濃度依賴性。表明As經(jīng)過降解后獲得的低分子質(zhì)量降解片段仍可有效誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化分泌TNF-α。H2O2-F2和HCl-F1誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的作用最強(qiáng)，且極顯著強(qiáng)于As；HCl-F2促進(jìn)TNF-α分泌的活性作用弱于As；而As經(jīng)過氧化降解獲得的組分H2O2-F1活化RAW264.7細(xì)胞分泌TNF-α的活性低于HCl-F1、HCl-F2和H2O2-F2。

表3 不同質(zhì)量濃度的As、HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1和H2O2-F2誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞活化產(chǎn)生TNF-α質(zhì)量濃度Table 3 TNF-α levels in RAW264.7 cells induced by various concentrations of As, HCl-F1, HCl-F2, H2O2-F1 and H2O2-F2

3 結(jié) 論

本研究采用酸水解法和氧化降解法降解As，通過超濾法結(jié)合凝膠過濾柱層析法對降解產(chǎn)物進(jìn)行分離和純化，得到了4 個As低分子質(zhì)量降解片段：HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1和H2O2-F2。基本組成分析結(jié)果表明HCl-F1、HCl-F2、H2O2-F1、H2O2-F2均為雜多糖且單糖和硫酸基團(tuán)組成存在較大差異，但其重均分子質(zhì)量相近。體外免疫誘導(dǎo)活性分析結(jié)果表明As、HCl-F1、HCl-F2和H2O2-F2均具有明顯的免疫誘導(dǎo)活性，并且由As降解得到的HCl-F1和H2O2-F2的免疫誘導(dǎo)活性較As均有明顯提高，而H2O2-F1免疫誘導(dǎo)活性較弱。結(jié)合化學(xué)組成和活性研究綜合分析表明，As低分子質(zhì)量片段的免疫誘導(dǎo)活性是由單糖組成和硫酸根質(zhì)量分?jǐn)?shù)共同決定的。本研究不僅可為As及其他海藻多糖低分子質(zhì)量降解片段的制備提供參考，也為As在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的進(jìn)一步開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。