李媛媛，毛相朝，唐彭皓，李彩龍，于 朋，王靜鳳*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東 青島 266003）

骨質(zhì)疏松癥是絕經(jīng)后婦女和老年人最普遍、復雜的骨骼代謝疾病，會引起骨組織內(nèi)單位體積骨量減少、骨微結(jié)構遭到破壞，正常荷載性能下降，骨脆性增加，以致骨組織受到低能量創(chuàng)傷即會引發(fā)骨折[1-2]。骨質(zhì)疏松性骨折（osteoporosis fracture，OPF）是骨質(zhì)疏松癥最常見、最嚴重的并發(fā)癥[3]。OPF的特點之一是發(fā)病率高：國際骨質(zhì)疏松基金會調(diào)研發(fā)現(xiàn)，全球范圍內(nèi)每3 s就會出現(xiàn)一起OPF病例；50 歲之后，1/2的女性和1/5的男性會遭遇一次骨折[4]。OPF特點二為致殘率高：與一般創(chuàng)傷性骨折相比，OPF愈合過程中骨內(nèi)、外膜表面骨形成不足，骨礦化沉積速率減慢，骨痂形成量減少；此外，骨重塑出現(xiàn)延遲，骨折區(qū)新生皮質(zhì)骨厚度變薄，最終延長了骨折愈合周期[5-7]，甚至會導致骨不連，新骨機械性能下降[8-9]，大大增加了發(fā)生二次骨折的風險[10-11]。因此具有高發(fā)病率、高致殘率特點的OPF對老年人尤其是絕經(jīng)后婦女的身心健康構成了巨大的威脅[12]，其漫長的恢復過程給患者的日常生活帶來了極大的不便，高昂的醫(yī)療費用還給家庭乃至社會帶來了沉重的經(jīng)濟負擔[13]，OPF已儼然成為新的全球威脅?，F(xiàn)在臨床上OPF的治療方式多為物理、基因和藥物治療，但是這些治療手段價格昂貴，且或多或少存在副作用，所以尋找安全有效的輔助治療措施成為了研究熱點。

以南極磷蝦為原料提取的南極磷蝦油（Antarctic krill oil，AKO）富含磷脂型二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）、二十二碳六烯酸（docosapentenoic acid，DHA）以及少量的蝦青素等多種活性因子[14-15]，研究發(fā)現(xiàn)AKO具有抗氧化[16]、強健大腦[17]、降血脂[18-19]、抗疲勞[20]等多種生物功能[21]。此外，近期研究發(fā)現(xiàn)，EPA、DHA可促進骨生成、改善軟骨細胞代謝[22]，而骨折愈合過程經(jīng)歷的軟骨內(nèi)骨化則與此有著密切的關系，因此本研究以富含磷脂型EPA和DHA的AKO為受試物，以軟骨內(nèi)成骨為切入點，系統(tǒng)地研究AKO對骨質(zhì)疏松骨折愈合的作用，以期為南極磷蝦油功能性食品開發(fā)提供理論參考，為OPF的輔助性治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

8 周齡雌性C57BL/6J小鼠，SPF級，體質(zhì)量（18.50±2.56）g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2012-0001，飼養(yǎng)溫度為22～24 ℃，相對濕度為52%～58%。

南極磷蝦油由中國海洋大學食品科學與人類健康實驗室贈予。AKO組成成分分析結(jié)果顯示其含有約57.4%（質(zhì)量分數(shù)，下同）磷脂、14.2%甘油三酯、15.3%游離脂肪酸、2.1%膽固醇和0.594‰蝦青素。EPA和DHA分別占總脂肪酸質(zhì)量的25.13%和19.24%。

阿侖膦酸鈉片 澳大利亞默沙東公司；血清中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、骨堿性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒 美國R & D公司；通用型組織固定液（中性） 武漢賽維爾生物科技有限公司；UNIQ-10柱式TRIzol總RNA抽提試劑盒及隨機引物 生工生物工程（上海）股份有限公司；TRIzol試劑 Ambion生物科技有限公司；RiboLock RNA酶抑制劑 美國Thermo Fisher Scientific公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 美國Promega公司；dNTP Mixture寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司；Aggrecan、Col10a、MMP-13、PDGF-BB、Ang1、Col1a、OCN β-actin引物 蘇州金唯智生物科技有限公司；SYBR Green熒光染料 美國Novoprotein 公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

Neofuge 13R 型高速冷凍離心機 力康生物醫(yī)療科技控股有限公司；Model680型酶標儀 美國Bio-Rad公司；LightCycler480實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 瑞士Roche公司；RM2125RTS石蠟切片機 德國Leica公司；BH14光學顯微鏡 日本Olympus公司；YLS-16A小動物骨骼強度測定儀 濟南益延科技發(fā)展有限公司；GK99-UNIGAMMA X-RAY PLUS雙能X射線骨密度儀意大利I’can公司；SCANCO微型計算機斷層掃描（micro computed tomography，μCT）儀 瑞士Scanco Medical AG公司；100型高效液相色譜儀 美國Aglient公司；ICS2000型離子色譜儀 美國Dionex公司；Ultra Trurrax T18 basic型高速勻漿機 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及模型建立

C57BL/6J小鼠隨機分為假手術組（Sham組，36 只）和去卵巢組（OVX組，90 只），腹腔注射水合氯醛（400 mg/kg mb）進行麻醉，Sham組切除卵巢周圍少量脂肪組織，OVX組行雙側(cè)去卵巢手術。術后3 個月，每組取4 只小鼠進行安樂死，取股骨進行骨密度分析，結(jié)果顯示，與Sham組相比，OVX組小鼠股骨骨密度顯著降低（P＜0.05），證明骨質(zhì)疏松模型建立成功（圖1A）。

圖1 小鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型的建立Fig. 1 Establishment of the osteoporotic fracture model

隨后小鼠于右脛骨中上1/3處行開放性骨折手術（圖1B）。將手術成功的小鼠進行分組：Sham組小鼠骨折后作為一般骨折對照組（Control組），去卵巢小鼠骨折后隨機分為骨質(zhì)疏松性骨折模型組（Model組）、陽性對照組（ALN組）、AKO組，每組27 只。骨折后立即灌胃受試物，其中Control組、Model組小鼠灌胃生理鹽水，ALN組小鼠灌胃阿倫磷酸鈉（質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL），AKO組小鼠灌胃南極磷蝦油（質(zhì)量濃度為30 mg/mL），灌胃劑量均為10 mL/kg mb。骨折術后第5天，每組取5 只小鼠禁食不禁水8 h，行尾靜脈取血，常規(guī)分離血清用于生化指標檢測。術后11、24 d每組取8 只小鼠禁食不禁水8 h，摘眼球取血，收集血清用于生化指標檢測；小鼠脫頸椎處死后，迅速分離右脛骨痂組織，用于組織形態(tài)學觀察（11、24、35 d，每組4 只）、2D μCT分析（24 d，每組3 只）、生物力學分析（56 d，每組4 只）及骨折愈合相關基因檢測（11、24 d，每組4 只）。

1.3.2 血清生化指標測定

參照ELISA試劑盒方法測定血清VEGF質(zhì)量濃度和BALP活力。

1.3.3 股骨組織骨密度測定

小鼠去卵巢術后3 個月，取股骨組織，采用雙能X射線骨密度測試儀檢測骨密度。

1.3.4 骨痂組織形態(tài)學觀察

小鼠右脛骨痂于組織固定液固定24 h，質(zhì)量分數(shù)8%乙二胺四乙酸二鈉（pH 7.3）脫鈣 2～3 周石蠟包埋切片（5 μm厚），進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色，光學顯微鏡下觀察骨痂組織學特點并成像。

1.3.5 骨痂2D μCT分析

小鼠骨折術后第24天取材骨痂組織，采用2D μCT掃描儀進行掃描，并使用配套軟件分析骨折區(qū)形態(tài)學參數(shù)。用ImageJ軟件分析2D μCT圖像獲得的愈傷組織橫切面，計算橫切面的最大長度和最小長度以評估愈傷組織的大小。

1.3.6 骨痂生物力學測定

在骨折后第56天取材骨痂組織，通過小鼠骨骼強度測試儀的3點彎曲測試來確定脛骨骨折區(qū)的最大彎曲剛度。

1.3.7 qPCR分析

取小鼠骨折后第11、24天骨痂組織，檢測骨折愈合相關基因mRNA相對表達量。采用總RNA抽提試劑盒法提取骨痂組織總RNA，取1 μg骨痂總RNA在反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV的催化下逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后進行熒光實時定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）擴增，各反應物用量參照Maxima SYBR Green qPCR Mastermix說明書要求。反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共45 個循環(huán)。相關目的基因的引物序列如表1所示，以β-actin作為內(nèi)參校正目的基因mRNA表達量。

表1 小鼠骨折愈合相關基因的引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR amplification of fracture healing related genes

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，并進行最小顯著性差異法和SNK（Student-Newman-Keuls）法組間比較分析，P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 AKO對小鼠血清生化指標的影響

圖2 AKO對小鼠血清生化指標的影響Fig. 2 Effect of AKO on serum biochemical indicators

由圖2A可知，各組VEGF表達高峰期集中在骨折后第5、11天，說明新血管的生成及入侵主要發(fā)生在骨折愈合的早中期。骨折后第5、11天，Model組血清VEGF質(zhì)量濃度較Control組均顯著降低，經(jīng)AKO干預后VEGF質(zhì)量濃度分別上升了6.39%和8.05%（P＜0.05），提示AKO在骨折愈合早中期促進血管新生與入侵。圖2B顯示，各組BALP在骨折術后第24天呈現(xiàn)高表達，表明這個時期是活躍的新骨形成階段。此外，骨折后第11天，與Control組相比，Model組血清BALP活力顯著降低，而AKO組極顯著升高（P＜0.01）。提示在骨折愈合期間，AKO可增強成骨細胞活性、促進新骨形成。

2.2 AKO對OPF愈合過程中軟骨痂至硬骨骨痂演變的影響

圖3 AKO對小鼠骨折后11 d骨痂組織形態(tài)學的影響Fig. 3 Effect of AKO on callus histomorphology at 11 days post-fracture

對不同時間點的骨痂組織切片進行HE染色，動態(tài)觀察骨痂形態(tài)學變化，從而反映軟骨內(nèi)骨化進程。如圖3所示，骨折手術后11 d，Control組骨折區(qū)愈傷組織由大量編織骨組織和少量軟骨組織組成。然而，Model組主要充斥大量軟骨愈傷組織，且多數(shù)處于增殖期。模型小鼠經(jīng)AKO干預后，骨痂中大量軟骨細胞變得肥厚，并伴有軟骨基質(zhì)降解和礦化新骨替代軟骨現(xiàn)象，表明AKO促進軟骨細胞肥大、凋亡及新骨礦化，使小鼠提前完成軟骨痂期過渡至硬骨痂期。

圖4 AKO對小鼠骨折后24 d骨痂組織形態(tài)學及微結(jié)構的影響Fig. 4 Effect of AKO on histomorphology and microstructure of callus at 24 days post-fracture

圖4 A表明，骨折后24 d軟骨性骨痂已經(jīng)轉(zhuǎn)化為硬骨骨痂，且逐漸豐富聚集演變成致密的板層骨橋接骨折斷端。結(jié)果顯示，Control組骨痂由致密的編織骨填充，且向成熟的板層骨轉(zhuǎn)變；而Model組編織骨含量較少，且疏松散亂。補給AKO后，小鼠骨痂內(nèi)編織骨的數(shù)量增加，且聚合呈片狀骨。結(jié)果提示AKO可以促進骨性骨痂的形成與成熟。此外，第24天愈傷組織的2D μCT分析（圖4C～E）表明，AKO通過增加相對骨體積（增加16.97%）、骨小梁數(shù)量（增加14.77%），降低骨小梁分離度（降低18.53%），使模型小鼠骨性骨痂微結(jié)構得到顯著改善。2D μCT結(jié)果顯示，AKO組較Model組骨痂橫截面最大長度減少了23.51%（P＜0.01）（圖4B、F），在一定程度上反映了AKO在骨折手術后第24天顯著降低了愈合組織的大小，加速后期骨重塑。

綜上表明，AKO通過加速軟骨細胞肥大和礦化、促進硬骨痂的形成與完善，增加愈傷組織的成熟，從而促進骨折愈合。

2.3 AKO對OPF愈合過程中硬骨痂塑形的影響

圖5 AKO對小鼠骨折后35 d骨痂組織形態(tài)學及56 d骨痂生物力學性能的影響Fig. 5 Effect of AKO on callus histomorphology at 35 days post-fracture and biomechanical properties of callus on at 56 days post-fracture

圖5 A顯示，骨折后35 d，Control組骨痂在將形成皮質(zhì)骨的區(qū)域觀察到致密的板層骨，而Model組骨折處的板層骨塑型不完全，間隙較大；灌胃AKO后，板層骨痂致密成熟，骨重塑能力顯著增強。骨折后56 d骨痂的彎曲剛度測試結(jié)果（圖5B）顯示，Model組骨痂結(jié)構強度較Control組顯著降低，說明骨質(zhì)疏松癥損害了OPF愈合質(zhì)量；經(jīng)AKO治療后，骨痂結(jié)構強度極顯著升高59.28%（P＜0.01）。以上結(jié)果提示，AKO可促進骨重塑的完成，使新骨快速恢復正常的機械強度，提高新骨的內(nèi)在質(zhì)量和抗外力性能。

2.4 AKO對軟骨內(nèi)成骨相關基因表達的影響

骨折愈合過程中軟骨內(nèi)成骨相關關鍵因子的mRNA相對表達量檢測結(jié)果顯示（圖6），骨折術后第11天，與Control組相比，Model組Aggrecan、Col10a表達量顯著升高；而MMP-13、PDGF-BB、Ang1、Col1a及OCN相對表達量顯著降低，直到術后第24天表達量才上升。提示Model組小鼠骨折后第11天愈合過程仍處于軟骨痂優(yōu)勢階段，直至第24天才集中發(fā)生軟骨礦化及骨性骨痂的重塑。說明由于骨質(zhì)疏松癥的影響，軟骨痂的成熟及礦化被嚴重推遲。模型小鼠灌胃AKO后，骨痂Aggrecan、Col10a表達量在術后第11天顯著下調(diào)，分別下降53.43%、20.47%；而MMP-13、PDGF-BB、Ang1、Col1a及OCN相對表達量在骨折后第11天顯著上調(diào)，分別升高85.53%、187.83%、115.5%、35.15%、134.74%。另外，圖6B、C顯示，骨折后第24天，AKO組小鼠MMP-13、PDGF-BB、Ang1表達量降低，而Col1a及OCN表達量顯著升高（P＜0.05）。以上結(jié)果提示，AKO可通過調(diào)控軟骨內(nèi)骨化相關基因的表達，促進血管入侵，加速OPF小鼠軟骨痂向鈣化軟骨痂轉(zhuǎn)變，從而加速骨折愈合。

圖6 AKO對小鼠軟骨內(nèi)成骨相關基因mRNA表達的影響Fig. 6 Effect of AKO on mRNA expression of key genes related to endochondral ossification

3 討 論

本實驗采用OVX手術及單側(cè)脛骨開放性骨折手術建立OPF模型，通過檢測OPF愈合過程中軟骨內(nèi)成骨時期和骨痂重塑期相關的各項指標，探究AKO對骨質(zhì)疏松模型小鼠骨折愈合的作用。結(jié)果表明，AKO可促進OPF愈合過程中的成軟骨分化、軟骨成熟肥大、軟骨基質(zhì)降解、新血管生成和新骨形成，加速軟骨內(nèi)骨化進程；促進硬骨痂塑型，增強新骨機械強度，提高愈合質(zhì)量。

骨折愈合是一個響應骨損傷而發(fā)生的復雜多階段的骨修復過程，其最終目標是使受損的骨返回到功能和生物力學健全的狀態(tài)。骨質(zhì)疏松性骨折愈合主要經(jīng)歷以下3 個緊密連接的階段：1）骨折斷端形成血腫、募集間充質(zhì)干細胞的炎癥期；2）骨膜反應為特征的膜內(nèi)成骨，以及經(jīng)歷軟骨骨痂-礦化軟骨痂-編織骨樣骨性骨痂的逐步過渡的軟骨內(nèi)骨化階段；3）包括骨再吸收和骨形成的骨痂重塑階段，使骨恢復原始形態(tài)和質(zhì)量[23-24]。

軟骨內(nèi)成骨階段是發(fā)生在骨質(zhì)疏松性骨折愈合早中期的重要階段：在此過程中，大量具有多向分化潛能的MSCs被募集到骨折斷端，在轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等生長因子作用下分化為軟骨細胞；軟骨細胞大量增殖，分泌軟骨蛋白聚糖；軟骨細胞成熟肥大，分泌X型膠原，形成軟骨骨痂[25]。隨后，由于軟骨痂機械強度無法滿足機體需求，它將被編織骨由外向內(nèi)逐漸替代：軟骨愈傷組織分泌MMP-13等因子進行軟骨基質(zhì)降解，最終軟骨細胞凋亡[26]；成骨細胞入侵增殖分化、分泌骨基質(zhì)并礦化成小梁骨，并逐漸匯聚成致密的板層骨，形成骨性骨痂連接骨折斷端[27]。骨折后第11、24天的骨痂HE、2D μCT結(jié)果顯示，相比于Model組小鼠，AKO組小鼠骨折區(qū)提前出現(xiàn)大量肥大軟骨細胞并伴有軟骨基質(zhì)降解，部分軟骨被礦化新骨代替，形成松散的小梁骨；隨后更快地轉(zhuǎn)變成了致密、骨微結(jié)構優(yōu)良的成熟板層骨。提示AKO通過促進軟骨內(nèi)骨化進程，改善骨質(zhì)疏松引起的骨折愈合延遲現(xiàn)象。

軟骨內(nèi)骨化進程受多種生長因子調(diào)控：其中Aggrecan、Col10a、MMP-13是軟骨細胞增殖、肥大、基質(zhì)降解的標志物[28-30]；VEGF、PDGF-BB、Ang是血管生成及入侵相關的關鍵調(diào)控因子[31]，促進氧分壓的改善及營養(yǎng)、成骨細胞和破骨細胞的運輸；BALP、Col1a、OCN表達量反映成骨細胞活性[32]，是重要的骨生成標志物，可以反應硬骨痂形成及重塑情況。血清及基因檢測結(jié)果顯示，模型小鼠灌胃AKO后，骨折后第11天的骨痂Aggrecan、Col10a表達量顯著降低，而MMP-13、VEGF、PDGF-BB、Ang1、ALP、Col1a及OCN的mRNA相對表達量顯著上調(diào)，表明AKO促進軟骨細胞增殖、肥大、凋亡及礦化。同時骨折后第24天，骨痂MMP-13、PDGF-BB、Ang1 mRNA相對表達量降低，而Col1a及OCN mRNA相對表達量顯著升高，說明AKO組已提前完成血管入侵，且加速了新骨的形成，進一步證明了AKO加速軟骨內(nèi)骨化，促進骨折愈合。

骨折愈合后期以骨重塑為主：為了恢復骨的原有模式，骨性骨痂進行骨塑形與改建，髓腔中多余的愈傷組織被吸收、清除，髄腔重新溝通，皮質(zhì)骨區(qū)演變出生物力學性能優(yōu)良的板層骨，恢復正常骨結(jié)構。此階段主要經(jīng)歷破骨細胞對松散的編織骨進行重吸收，并伴隨成骨細胞形成新的成熟板層骨的爬行替代過程，使原始骨痂的形狀和大小被重塑[33]，生物力學性能得到改善[34-35]。骨折后第35天，組織學觀察結(jié)果顯示AKO組較Model組具有更強的骨重塑能力，形成致密的新骨橋接骨折斷端。骨折后第56天，AKO組骨痂最大彎曲剛度較Model組顯著增加，說明骨折愈合質(zhì)量更優(yōu)。綜上結(jié)果表明，AKO能夠在骨折愈合末期促進骨性骨痂重塑，優(yōu)化骨痂力學結(jié)構。

綜上所述，AKO通過調(diào)控血管生成因子、軟骨內(nèi)成骨相關因子的表達以及成骨細胞活性來增強血管入侵、軟骨內(nèi)成骨以及骨重塑，改善因骨質(zhì)疏松導致的骨折愈合延遲與損傷，提高愈合質(zhì)量。