劉垚彤，孫 偉，董墨思，冀迎昕，李拖平，李蘇紅*

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧 沈陽 110866）

馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）是茄科茄屬多年生塊莖草本植物，營養(yǎng)豐富，素有“地下蘋果”和“第二面包”之稱，是位居小麥、水稻、玉米之后的第四大糧食作物[1]。馬鈴薯蛋白質(zhì)由19 種氨基酸組成[2]，其中必需氨基酸含量為20.1%，占總氨基酸的47.9%，與雞蛋蛋白必需氨基酸/總氨基酸（49.7%）相當，比聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織/世界衛(wèi)生組織已確定的標準蛋白（36.0%）要高，且致敏蛋白含量較少[3]，賴氨酸比例高。馬鈴薯蛋白質(zhì)按分子質(zhì)量大小分為高分子質(zhì)量蛋白質(zhì)、Patatin（馬鈴薯糖蛋白）和蛋白酶抑制劑3 部分[4-9]。Patatin為主要的貯藏蛋白，已被證明具有優(yōu)異的起泡性、乳化能力、抗氧化能力和酯?；饷福╨ipid acyl hydrolase，LAH）活性[10-13]，可以用作食品加工領(lǐng)域具有高功能價值的食品配料及輔料。

在我國，馬鈴薯主要用于生產(chǎn)淀粉，這一過程中產(chǎn)生的大量廢液稱為馬鈴薯汁。據(jù)統(tǒng)計，1 000 kg馬鈴薯生產(chǎn)淀粉的過程可以產(chǎn)生5～12 m3的廢液，其中含有質(zhì)量分數(shù)1%～2%的蛋白質(zhì)[14]。同時廢液中含有蛋白質(zhì)、肽、氨基酸和胺類物質(zhì)，這會造成工業(yè)上處理廢液的成本高昂[15]。若將馬鈴薯汁直接排放，不僅造成蛋白資源的大量浪費，還造成環(huán)境污染。目前，環(huán)境改善是全球關(guān)注的重點之一，同時植物性蛋白質(zhì)資源在世界蛋白質(zhì)資源中也占有重要的地位。所以，如何更有效地利用工業(yè)淀粉廢液提取Patatin并全方位開發(fā)其功能性，以及在食品領(lǐng)域的更多應(yīng)用性將成為今后的研究熱點。

本文介紹了Patatin的分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)特性、物化特性及功能特性，綜述了國內(nèi)外關(guān)于Patatin的提取、分離純化方法，及在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究，為馬鈴薯蛋白資源的進一步開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 Patatin的分子質(zhì)量及結(jié)構(gòu)特性

圖1 馬鈴薯蛋白SDS-PAGE圖Fig. 1 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis pattern of total proteins in potato tubers

圖1 為馬鈴薯蛋白十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacryl amide gel electrophoresis，SDS-PAGE）圖。Patatin分子質(zhì)量為39～45 kDa，是馬鈴薯蛋白質(zhì)中的酸性蛋白組分，占總蛋白質(zhì)量的30%～40%左右。蛋白酶抑制劑的分子質(zhì)量為5～25 kDa，屬于馬鈴薯蛋白質(zhì)中堿性蛋白組分，占總蛋白質(zhì)量的50%左右。高分子質(zhì)量蛋白組分則占總蛋白質(zhì)量的10%左右，目前有關(guān)其功能性質(zhì)的研究報道較少。

Patatin是糖和蛋白的復(fù)合物，含有32%的糖和64%的蛋白質(zhì)，孫瑩等[16]通過氣相色譜得到分子質(zhì)量為40.6 kDa的馬鈴薯糖蛋白Patatin，并與標準混合單糖氣相色譜進行對比，確定其單糖組成為：鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖（圖2），這些單糖組成可能與其生理活性相關(guān)。Tsukagoshi等[17]發(fā)現(xiàn)云芝中的多糖Krestin（polysaccharride-K，PSK）具有抗腫瘤活性，推測是其結(jié)構(gòu)中的葡萄糖、甘露糖、果糖、木糖和半乳糖發(fā)揮了作用。目前馬鈴薯濃縮蛋白的抗腫瘤作用已得到證實[18]，Patatin結(jié)構(gòu)與生理活性的構(gòu)效關(guān)系還有待進一步深入研究。此外，Patatin中含有吡喃型α-糖苷鍵，β-消去反應(yīng)前后經(jīng)紫外光譜測定表明，糖鏈的存在提高了Patatin的抗變性能力。同時甘露糖的存在使Patatin對甘露糖有高度的親和力，可以吸附到ConA-瓊脂糖凝膠介質(zhì)上進行親和純化。

圖2 標準混合單糖（A）和Patatin（B）氣相色譜圖[16]Fig. 2 Gas chromatograms of mixed monosaccharide standards (A)and patatin (B)[16]

Patatin是由兩個多基因組（Class I和Class II）表達的，兩個多基因組的同源度可達98%。其中，Class I基因組主要在馬鈴薯塊莖中表達且表達量大，Class II在整個植物體系都有表達但表達量較小[19-21]。Patatin在自然狀態(tài)下常以二聚體形式存在，不同品種或相同品種的馬鈴薯中都存在異型體，由于基因的高度同源性，這些異構(gòu)體之間的結(jié)構(gòu)特性和熱穩(wěn)定性沒有顯著差異，在pH 6～8的范圍內(nèi)，Patatin的構(gòu)象最穩(wěn)定[22-23]。Patatin的一級結(jié)構(gòu)由362 個氨基酸殘基組成，一般不受外界環(huán)境因素的影響[24-26]。而二、三級結(jié)構(gòu)容易受外界環(huán)境因素的影響，但pH值引起Patatin的側(cè)鏈氨基酸殘基微環(huán)境的變化是可逆的。在pH 4、5條件下，Patatin的二級結(jié)構(gòu)均以α-螺旋和β-折疊為主；pH 6～9條件下，Patatin的二級結(jié)構(gòu)均以β-折疊為主；在溫度低于40 ℃時，Patatin結(jié)構(gòu)與溫度變化的相關(guān)性不明顯；隨著溫度升高，α-螺旋含量迅速下降，無規(guī)卷曲含量迅速增加，當溫度達到80 ℃時，無規(guī)卷曲占主導(dǎo)地位，α-螺旋含量仍然保持在25%以上，說明Patatin是一種高熱穩(wěn)定性蛋白；而尿素、DDT等變性劑會對Patatin二級結(jié)構(gòu)造成巨大破壞，使其結(jié)構(gòu)由有序變成無序[27]。

2 Patatin物化性質(zhì)及功能特性

Patatin具有較好的溶解性、乳化性、起泡性及凝膠性，還具有抗氧化活性、LAH活性，LAH具有催化磷脂、糖脂、單/二?；视鸵约伴L鏈脂肪酸酯的非特異性水解活性。Patatin的必需氨基酸指數(shù)（essential amino acid index，EAAI）為89%，比許多動植物蛋白的EAAI高[28]。

2.1 溶解度

Patatin溶解度受溫度、pH值、鹽離子種類及強度、有機溶劑種類及強度等因素的影響。在溫和的酸性條件下，離子強度和未折疊的Patatin影響馬鈴薯總蛋白的溶解度[29-30]。Patatin在pH值小于3和大于6的條件下溶解度為100%，在等電點附近（4.0～5.2）溶解度最小，而蛋白酶抑制劑則在整個pH值范圍內(nèi)均是可溶的。相同pH值條件下，添加FeCl3會增加溶解度；添加乙醇，則溶解度隨pH值和熱處理溫度的變化而發(fā)生微小變化。利用Patatin和蛋白酶抑制劑溶解性的差異，可實現(xiàn)兩者從馬鈴薯淀粉廢液中的初步分離，為后續(xù)Patatin的大量純化制備提供了可能。

2.2 凝膠性

Patatin在加熱過程中形成凝膠主要經(jīng)過兩個階段，第1階段是初始的球狀蛋白結(jié)構(gòu)部分變性，第2階段是蛋白分子之間的聚合[31]。因為球蛋白本身變性不足以引起凝膠化，需要分子間相互結(jié)合形成一個連續(xù)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，進而促進聚集和凝膠化；因此，第2階段在Patatin凝膠過程中起主要作用。Patatin凝膠性也受到pH值、溫度、離子強度和加熱時間等因素的影響。Pots等[32]發(fā)現(xiàn)Patatin在等電點附近時，無論是否存在NaCl，Patatin的熱聚合敏感性都較高，而遠離等電點且無NaCl存在時，則難以發(fā)生熱聚合。與馬鈴薯分離蛋白的凝膠條件（蛋白質(zhì)量濃度高于6 g/100 mL、pH 7.0、加熱溫度90 ℃、加熱時間30 min）相比，Patatin凝膠所需的溫度更低（蛋白質(zhì)量濃度高于6 g/100 mL、pH 7.0、加熱溫度69 ℃、加熱時間30 min），更容易形成凝膠。而與β-乳球蛋白、卵清蛋白和大豆蛋白相比，Patatin凝膠形成所需的離子強度更低[33-34]。因此，Patatin具有良好的凝膠性，可作為一種新型的凝膠蛋白應(yīng)用于食品中。

2.3 乳化性和起泡性

馬鈴薯蛋白具有較好的乳化性和起泡性。常溫下，蛋白酶抑制劑的乳化特性顯著優(yōu)于Patatin，但是加熱處理后，Patatin卻具有更好的乳化穩(wěn)定性[29]。Patatin的乳化性隨pH值和離子強度的變化而變化。Ralet等[35]研究發(fā)現(xiàn)，Patatin在等電點附近且無NaCl存在時可以獲得最好的乳化性，發(fā)泡能力和泡沫穩(wěn)定性均優(yōu)于卵清蛋白粉；在任意的pH值和離子強度下，加熱處理Patatin乳狀液都有助于其形成更穩(wěn)定的體系。van Koningsveld等[12]通過攪打?qū)嶒灪凸呐輰嶒灠l(fā)現(xiàn)，在未改性馬鈴薯蛋白中，Patatin的起泡性較差，但泡沫穩(wěn)定性較好。

2.4 抗氧化活性

Patatin有12 種可溶的、暴露的且具有自由基清除能力的氨基酸，如甲硫氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、半胱氨酸和組氨酸[36]。Liu等[8]對Patatin進行了體外抗氧化活性實驗，發(fā)現(xiàn)Patatin具有較高的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力、抗低密度脂蛋白過氧化反應(yīng)能力及保護DNA免受羥自由基損傷活性；Sun Ying等[37]研究發(fā)現(xiàn)Patatin也是一種能有效抑制小鼠黑素瘤B16細胞增殖的抗增殖劑。因此，Patatin可能是一種極具潛力的癌癥預(yù)防蛋白源和食品功能因子。

2.5 酶活性

Patatin具有LAH活性[28,38-39]。提取方式會對Patatin的LAH活性產(chǎn)生影響。凝膠色譜與離子交換色譜相結(jié)合分離出的Patatin具有LAH活性[40]；酸沉淀法和(NH4)2SO4沉淀法所得分離蛋白對O-硝基苯丁酸酯和4-硝基苯月桂酸酯都具有較高的水解活性；熱酸結(jié)合法所得的蛋白水解酶活性較低；羧甲基纖維素鈉絡(luò)合法和FeCl3沉淀法所得蛋白則對4-硝基苯月桂酸的水解活性遠高于O-硝基苯丁酸酯[22]；Depol 670L（DEP）多酶系統(tǒng)提取的Patatin蛋白提取物具有較高的LAH活性[41]。膨化床法分離所得4 種蛋白組分，其中只含有蛋白酶抑制劑的組分LAH活性幾乎為零，而同時含有Patatin和蛋白酶抑制劑的組分都表現(xiàn)出LAH活性[42]。說明色譜法、酸沉淀法、(NH4)2SO4沉淀法、酶法以及膨化床可以較好地保留Patatin的LAH活性。目前揭示Patatin的LAH活性機理及影響因素的研究較少，進一步的研究將促進Patatin作為新型天然酶制劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用和發(fā)展。

3 蛋白提取、分離與純化

3.1 馬鈴薯粗蛋白的提取方法

目前，已有許多從馬鈴薯廢液中提取蛋白質(zhì)的物理及化學(xué)方法。如Na2SO4溶液浸提法，雖然得率不高但是操作簡單，且得到的蛋白質(zhì)無毒，可用于食品加工；熱聚合和酸沉淀法是工業(yè)上常用的方法，操作簡單、成本低，由于會造成蛋白功能活性喪失，所以不適用于食品加工；膜回收法自動化程度高、穩(wěn)定性好但成本高；等電點法、鹽析法超濾法、酶法、膨化床吸附層析法及新型分離提取技術(shù)磁性殼聚糖微球法也都各具優(yōu)缺點，具體見表1。

表1 Patatin的提取方法Table 1 Comparison of extraction methods for patatin

3.2 Patatin的分離與純化

表2 Patatin的純化方法Table 2 Comparison of purification methods for patatin

馬鈴薯蛋白中Patatin的進一步分離純化常采用凝膠過濾色譜法、離子交換色譜法、凝膠色譜與離子交換色譜相結(jié)合的方法、反相色譜法及基因表達法等，不同方法各具優(yōu)缺點（表2）。但是目前的方法提取量小、成本高，有一定的局限性，研究和完善Patatin用于大規(guī)模提取和工業(yè)化生產(chǎn)的純化方法，將會成為今后研究的熱點。

4 Patatin在食品中的應(yīng)用研究

4.1 作為保護性納米載體材料

David等[57]發(fā)現(xiàn)以Patatin為主要成分的馬鈴薯分離蛋白與VD結(jié)合形成的聚集體要比單獨的VD顆粒尺寸小得多，溶液透明度也更好，且二者形成的納米復(fù)合體可以減少巴氏滅菌過程和不同貯藏條件下的VD損失。因此，馬鈴薯蛋白有望成為VD或其他疏水性食品功能因子的良好保護性載體，用于澄清飲料或其他食品生產(chǎn)中，以促進人類健康。關(guān)于純化后單一蛋白與VD是否還可形成聚集體，以及Patatin的相對含量對復(fù)合體的形成是否有影響，都有待深入研究。

4.2 作為紅葡萄酒澄清劑

在葡萄酒釀造過程中，通常使用幾種動物蛋白來調(diào)節(jié)其最重要的感官特征——澀味。澀味主要是唾液蛋白與多酚類物質(zhì)作用產(chǎn)生沉淀造成的。而用于澄清的蛋白質(zhì)是通過類似于唾液與多酚反應(yīng)的機制與葡萄酒中的單寧作用達到目的。Gambuti等[58]比較了Patatin、酪蛋白酸鉀、明膠和卵蛋白作為澄清劑的效果，發(fā)現(xiàn)相同濃度下用Patatin處理后的紅酒中總酚、單寧含量和澀味減少得更多，色度特征沒有損耗，但Patatin在葡萄酒的低pH值條件下溶解度很低；所以Patatin不僅可去除澀味，同時也易被分離去除，不會造成潛在的不穩(wěn)定性。動物蛋白在易感人群中具有潛在的致敏性，Patatin作為植物來源的蛋白引起了越來越多的關(guān)注，可作為一種非致敏性蛋白替代動物蛋白。

4.3 作為生物活性肽調(diào)節(jié)血壓和體液平衡

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）和腎素是腎素-血管緊張素系統(tǒng)中的兩個關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在血壓和體液平衡中起著重要的生理作用。腎素通過裂解血管緊張肽原，產(chǎn)生血管緊張素-I，再通過ACE轉(zhuǎn)化成血管緊張素-II（一種維持正常血壓的有效血管收縮劑），由于血管緊張素-I轉(zhuǎn)化為血管緊張素-II不依賴于ACE，造成了某些抗高血壓藥物治療效果并不理想。

Fu Yu等[59]通過In Silico Analysis軟件模擬了馬鈴薯Patatin的兩個衍生肽Trp-Gly（WG）和Pro-Arg-Tyr（PRY）對ACE和腎素活性的抑制作用。WG和PRY的ACE半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為231.22、97.59 mol/L；與已知的從大麻籽、油菜、豌豆蛋白和微藻中鑒定出幾種腎素抑制肽相比，Patatin的IC50接近大麻籽（54～93 mol/L），遠高于豌豆肽（9.20～22.66 mmol/L）和菜籽肽（0.968～3.061 mmol/L）。根據(jù)酶抑制動力學(xué)，推測出WG和PRY對ACE抑制作用分別為非競爭性和競爭性模式，而對腎素的抑制作用都為混合型；利用固有發(fā)射熒光光譜法，發(fā)現(xiàn)與WG相比，PRY表現(xiàn)出對ACE和腎素分子更強的親和力，被確定為更有效的ACE和腎素抑制劑。目前與使用的各種酶抑制劑相比，Patatin的衍生肽能同時抑制腎素和ACE活性，有望成為新型的高血壓治療藥物或添加劑。

4.4 水解短鏈脂肪酸的三?；视王?/h3>

成熟奶酪風味的形成是一系列復(fù)雜的生化反應(yīng)的結(jié)果，主要來自于成熟過程中酶和微生物作用產(chǎn)生的化合物。奶酪中脂肪分解酶主要來源于牛奶、酸性乳酸菌、霉菌和酵母、凝乳糊的脂肪酶和外源脂肪酶[60-62]，外源性脂肪酶在乳品工業(yè)中使用不僅能增加乳酪味道，而且還加速乳酪成熟，但成本較高。Spelbrink等[63]研究了Patatin在奶酪成熟中應(yīng)用的可能性，分別測定了Patatin對三酰甘油底物鏈長度為C2、C4、C6、C8、C12的水解活性，發(fā)現(xiàn)當?shù)孜镦滈L為C6時活性最強，C4、C8、C2次之，而對C12幾乎沒有水解活性，說明Patatin可以水解水溶性強、疏水性小的甘油三酯；Patatin添加到奶酪中，會釋放適量的游離脂肪酸來提高風味物質(zhì)的含量，而不會過度分解脂肪和發(fā)生酸?。桓鶕?jù)Arrhenius動力學(xué)，發(fā)現(xiàn)Patatin在中等溫度下的水溶液和乳清蛋白溶液中均失活。另外，通過巴氏殺菌法可以使Patatin失活，且副反應(yīng)較少，所以Patatin有望作為新的外源性脂肪酶添加到奶酪制作中改善風味，或在乳品工業(yè)中使用，同時可以將馬鈴薯淀粉廢液大規(guī)?；厥绽茫瑴p少資源浪費，保護環(huán)境。

5 結(jié) 語

我國有豐富的馬鈴薯蛋白資源，是重要的工業(yè)和食品原料。Patatin具有良好的溶解性、凝膠性、乳化性和抗氧化性等，在功能性食品、保健性食品和藥品等方面都有廣闊的應(yīng)用前景。Patatin功能性的深入研究及應(yīng)用領(lǐng)域的進一步拓展，不僅可以使馬鈴薯蛋白資源得到充分的利用，同時能夠減少環(huán)境污染，提高經(jīng)濟效益。進一步提高Patatin提取純度、保持蛋白的活性及功能穩(wěn)定性，以最節(jié)約的成本和最簡單的方法將Patatin的分離純化落實到工業(yè)化生產(chǎn)是Patatin產(chǎn)品研究開發(fā)的基礎(chǔ)。隨著我國馬鈴薯主食化產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，Patatin的營養(yǎng)功能及其在食品領(lǐng)域的應(yīng)用研究將日益得到關(guān)注和重視。因此，優(yōu)化Patatin的分離純化方法，探索其在食品加工過程中的變化規(guī)律，開發(fā)以Patatin為原輔料的保健食品和藥品將成為今后的研究熱點。