崔玲娣 劉凱

摘要：目的 ?觀察鴉膽子苦醇（BRU）對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞凋亡的影響，探討其作用機(jī)制。方法 ?用BRU處理MCF-7細(xì)胞。采用CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCF-7細(xì)胞抑制率和凋亡率，Western blot檢測(cè)線粒體凋亡通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）相關(guān)蛋白的表達(dá)，利用免疫熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)Nrf2和p53蛋白定位。結(jié)果 ?與對(duì)照組比較，BRU顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖，110 nmol/L BRU誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡有時(shí)間依賴性。110 nmol/L BRU顯著降低Nrf2及下游蛋白表達(dá)，顯著增加GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4、CHOP、Apaf-1、Bax/Bcl-2、Cytochrome C、Cleaved-caspase3、p53和p21蛋白的表達(dá)（P<0.05，P<0.01，P<0.001），細(xì)胞核Nrf2蛋白含量減少、p53蛋白含量增加。結(jié)論 ?BRU通過(guò)誘發(fā)ERS，抑制Nrf2蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)移，破壞抗氧化作用，誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡。

關(guān)鍵詞：鴉膽子苦醇;人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;細(xì)胞凋亡

中圖分類號(hào)：R285.5 ???文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ???文章編號(hào)：1005-5304（2019）05-0044-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.05.010 開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Abstract： Objective To investigate the effects of brusatol （BRU） on apoptosis of human breast cancer MCF-7 cells; To discuss its mechanism of action. Methods MCF-7 cells were treated with BRU. The inhibitory ratio and apoptotic ratio of MCF-7 cells was detected by CCK-8 assay and flow cytometry， respectively. Western blot was used to detect the expression of mitochondrial apoptosis pathway and endoplasmic reticulum stress （ERS）-related protein， and Nff2 and p53 protein localization were achieved by immunofluorescence technique. Results Compared with the control group， BRU could significantly inhibit the proliferation of MCF-7 cells， and 110 nmol/L BRU induced MCF-7 cells apoptosis in a time-dependent manner. 110 nmol/L BRU significantly decreased the expression of Nrf2 and downstream proteins， and significantly increased expression of GRP78， p-PERK/PERK， p-eIF2α/eIF2α， ATF4， CHOP， Apaf-1， Bax/Bcl-2， Cytochrome C， Cleaved-caspase3， p53 and p21 proteins （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. The content of Nrf2 protein decreased and the content of p53 protein increased. Conclusion Through inducing ERS， BRU inhibits Nrf2 protein expression and nuclear transfer， destroys antioxidant activity， and induces apoptosis in MCF-7 cells.

Keywords： brusatol; human breast cancer MCF-7 cell; endoplasmic reticulum stress; apoptosis

乳腺癌發(fā)病率已上升至女性惡性腫瘤第1位，成為婦女健康的最大威脅[1]。目前，臨床上大多采用放療和化療來(lái)延長(zhǎng)乳腺癌患者的生存期、緩解癥狀，但治療有效率較低，毒副反應(yīng)大。臨床上，癌細(xì)胞抗藥是目前癌癥藥物治療難以解決的棘手問(wèn)題，主要原因之一是核轉(zhuǎn)錄因子2（Nrf2）發(fā)揮的細(xì)胞保護(hù)作用。已有研究顯示，腫瘤Nrf2異常激活，與癌癥藥物治療和輻射抗性有關(guān)[2]。近年來(lái)，一種源于苦木科植物鴉膽子種子喹諾酮——鴉膽子苦醇（brusatol，BRU）引起研究人員的關(guān)注。有實(shí)驗(yàn)表明，BRU能通過(guò)抑制Nrf2表達(dá)，抑制多種癌細(xì)胞增殖，是潛在的天然抗腫瘤藥物[3]。但BRU具體通過(guò)何種途徑抑制Nrf2表達(dá)，至今尚未闡明。一些天然產(chǎn)物可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS），進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[4]，這為闡明BRU的作用機(jī)制提供了契機(jī)。ERS對(duì)維持細(xì)胞正常穩(wěn)態(tài)起重要作用，細(xì)胞發(fā)生嚴(yán)重的ERS，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[5]。因此，本實(shí)驗(yàn)從BRU可能誘發(fā)人乳腺癌細(xì)胞ERS這一推斷出發(fā)，將ERS與Nrf2鏈接起來(lái)，探討B(tài)RU通過(guò)誘發(fā)ERS激活p53，達(dá)到抑制Nrf2表達(dá)的作用，為人乳腺癌的藥物治療提供依據(jù)。

1 ?材料和方法

1.1 ?藥物

BRU，美國(guó)Sigma公司，使用時(shí)用二甲基亞砜（DMSO）溶解，并使BRU的終濃度低于0.01 g/L。

1.2 ?主要試劑與儀器

CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和DAPI，美國(guó)BD;Apaf-1、Bax、Bcl-2、Cytochrome C、Cleaved-caspase 3、Nrf2、HO-1、NQO-1、p53、MDM2、p21、PERK、p-PERK、GRP78、ATF4、eIF2α、p-eIF2α、CHOP及β-actin單克隆抗體，美國(guó)Abcam公司;辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗鼠二抗和FITC標(biāo)記的熒光二抗，北京博奧森公司;RPM 1640培養(yǎng)基和胎牛血清，北京全式金生物技術(shù)有限公司。雙人單面凈化工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），流式細(xì)胞儀（德國(guó)默克密理博公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Protein Sample），酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司），電泳儀、電泳槽（美國(guó)Bio-Rad），激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Zessi）。

1.3 ?細(xì)胞培養(yǎng)

人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物保藏所。細(xì)胞在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4 ?細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MCF-7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1.5×104個(gè)/孔，接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，加經(jīng)培養(yǎng)液稀釋的20、40、60、80、100 nmol/L BRU，繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h，收樣。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加10 μL CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)2 h。于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)定各孔吸光度（A），計(jì)算抑制率[（A對(duì)照-A給藥）÷（A對(duì)照-A空白）×100%]。用GraphPad Prism5軟件繪制增殖抑制率曲線。

1.5 ?細(xì)胞凋亡分析

根據(jù)細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)得出BRU的IC50，MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%時(shí)，加入IC50 BRU，培養(yǎng)12、24、48 h后收集細(xì)胞，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗3次，經(jīng)0.25%胰酶消化1 min，用PBS懸浮細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL。按Annexin V- FITC/PI凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡率，計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，IDEAS軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，每組至少重復(fù)3次。

1.6 ?蛋白表達(dá)測(cè)定

MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)70%時(shí)，用10 ?mol/L阿霉素（Dox）處理細(xì)胞24 h，作為陽(yáng)性對(duì)照。用IC50/2、IC50和2×IC50 BRU處理MCF-7細(xì)胞24 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗3次，加入100 μL蛋白裂解液，冰浴裂解20 min，經(jīng)12 000×g離心10 min，收集上清液。經(jīng)Bradford法定量后，用12%SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗4 ℃過(guò)夜和二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法顯色，Protein Sample凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄，并用系統(tǒng)自帶軟件分析灰度值。

1.7 ?蛋白免疫熒光定位

將多聚賴氨酸處理過(guò)的蓋玻片置于6孔板，調(diào)整MCF-7 細(xì)胞密度至5×104個(gè)/mL，接種細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)到70%左右時(shí)，用IC50的BRU處理MCF-7 細(xì)胞24 h，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗3次，用4%多聚甲醛固定，經(jīng)室溫干燥。用0.2%Triton X-100透化細(xì)胞10 min，PBS清洗3次，用5%BSA封閉細(xì)胞30 min，經(jīng)一抗4 ℃過(guò)夜和熒光二抗孵育。用終濃度為0.5 ?g/mL的DAPI染色10 min，PBS清洗3次，將蓋玻片置于載玻片，封片，用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照。

1.8 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。符合正態(tài)分布，組間比較用方差分析，方差齊用LSD法，方差不齊用Tamhane'T2法;不符合正態(tài)分布，采用非參數(shù)統(tǒng)計(jì)中多個(gè)獨(dú)立樣本Kruskal- Wallis H檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 ?結(jié)果

2.1 ?鴉膽子苦醇對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖、凋亡的影響

BRU對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性。20～100 nmol/L BRU對(duì)MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)有不同程度的抑制作用，在12、24、48 h的IC50值分別為157.2、109.5、108.2 nmol/L（見(jiàn)圖1）。24、48 h 的IC50接近，這表明110 nmol/L BRU可顯著抑制MCF-7細(xì)胞增殖。因此，選用該濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的濃度。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，110 nmol/L BRU作用MCF-7細(xì)胞12、24、48 h后，細(xì)胞凋亡率顯著增加，表明BRU可時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡（見(jiàn)圖2），24 h細(xì)胞凋亡率已顯著增加。因此，選取24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)。

2.2 ?鴉膽子苦醇對(duì)MCF-7細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子2及下游蛋白表達(dá)的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，BRU可降低Nrf2及下游蛋白的表達(dá)，見(jiàn)圖3。細(xì)胞核Nrf2含量減少，見(jiàn)圖4（紅色熒光代表Nrf2蛋白，藍(lán)色熒光代表細(xì)胞核）。提示BRU對(duì)MCF-7細(xì)胞Nrf2表達(dá)有抑制作用，BRU可破壞MCF-7細(xì)胞抗氧化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

2.3 ?鴉膽子苦醇對(duì)MCF-7細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

選取ERS標(biāo)志蛋白GRP78和PERK/eIF2α/ATF4/ CHOP信號(hào)通路評(píng)判MCF-7細(xì)胞ERS狀況。Western blot結(jié)果顯示，BRU可增加GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4和CHOP表達(dá)，見(jiàn)圖5。

2.4 ?鴉膽子苦醇對(duì)MCF-7細(xì)胞線粒體凋亡通路蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，BRU可增加Bax/Bcl-2、Apaf-1、Cytochrome C和Cleaved-caspase 3表達(dá)，見(jiàn)圖6。

2.5 ?鴉膽子苦醇對(duì)MCF-7細(xì)胞p53和p21蛋白表達(dá)的影響

p53蛋白在細(xì)胞凋亡中起重要的調(diào)控作用，它可作為轉(zhuǎn)錄因子激活p21，阻滯細(xì)胞進(jìn)程，引起凋亡。Western blot結(jié)果顯示，BRU可顯著增加p53、MDM2和p21的表達(dá)，見(jiàn)圖7。細(xì)胞核中p53陽(yáng)性表達(dá)增加，見(jiàn)圖8（紅色熒光表示p53蛋白，綠色熒光表示細(xì)胞核）。

3 ?討論

近年來(lái)，從天然產(chǎn)物中篩選癌癥治療藥物成為癌癥預(yù)防和治療研究的熱點(diǎn)。臨床試驗(yàn)表明，BRU可有效抑制乳腺癌、胃癌、前列腺癌和結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，是潛在的天然抗腫瘤藥物[6]。雖然BRU可通過(guò)抑制Nrf2表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，但具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑尚不十分清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)維持細(xì)胞正常生理功能有重要作用[7]，ERS能促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)對(duì)蓄積在網(wǎng)腔內(nèi)的錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白質(zhì)的處理，從而更好維持細(xì)胞的正常功能并使之存活。但是，發(fā)生持續(xù)嚴(yán)重的ERS可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。為探討B(tài)RU引起的ERS與Nrf2表達(dá)的關(guān)系，本研究對(duì)Nrf2、PERK/eIF2α/ATF4/CHOP信號(hào)通路、p53表達(dá)和線粒體凋亡途徑進(jìn)行分析，以期揭示BRU抑制Nrf2表達(dá)的內(nèi)在機(jī)制。

本研究結(jié)果表明，BRU可顯著抑制MCF-7細(xì)胞生長(zhǎng)。經(jīng)110 nmol/L BRU處理MCF-7細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，BRU明顯誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞發(fā)生凋亡。GRP78是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的伴侶蛋白，當(dāng)ERS發(fā)生時(shí)其表達(dá)顯著增加[9]，轉(zhuǎn)錄因子CHOP是ERS激活的細(xì)胞凋亡途徑的關(guān)鍵參與者[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，GRP78和CHOP蛋白過(guò)表達(dá)，表明BRU激活了ERS凋亡途徑。ERS激活PERK，進(jìn)而磷酸化eIF2α，抑制mRNA翻譯成蛋白質(zhì)，磷酸化的eIF2α也能激活A(yù)TF4表達(dá)，并導(dǎo)致CHOP表達(dá)升高[11]。BRU促進(jìn)p-PERK、p-eIF2α、ATF4和CHOP的表達(dá)上調(diào)，表明BRU通過(guò)PERK/eIF2a/ATF4/CHOP信號(hào)通路激活ERS，導(dǎo)致MCF-7細(xì)胞凋亡。

本研究表明，ERS在BRU誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞中起核心調(diào)控作用。一方面，BRU通過(guò)誘發(fā)ERS，激活PERK，活化的PERK磷酸化eIF2α，使信使RNA翻譯成蛋白質(zhì)的功能被抑制，造成ATF4蛋白表達(dá)上調(diào)，ATF上調(diào)后能夠促進(jìn)讀碼框移位蛋白（alternative reading frame protein，ARF）與MDM2結(jié)合，使MDM2與p53解離，抑制p53的泛素化降解，穩(wěn)定和激活p53。p53被激活后，發(fā)生核轉(zhuǎn)移，與ARF的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，抑制Nrf2下游抗氧化蛋白NQO1和HO-1表達(dá)，使細(xì)胞活性氧含量升高，進(jìn)而抑制Nrf2活性，誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡[12];p53被激活后，促進(jìn)p21的轉(zhuǎn)錄，增加p21蛋白的表達(dá)，使MCF-7細(xì)胞發(fā)生G1/S期阻滯，進(jìn)一步誘導(dǎo)凋亡[13]。此外，BRU通過(guò)誘發(fā)ERS，激活線粒體凋亡途徑，ERS通過(guò)減弱bcl-2表達(dá)，激活CHOP并誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡[14];同時(shí)，ERS又能直接激活Caspase-3，加速M(fèi)CF-7細(xì)胞凋亡[15]。

綜上所述，BRU抑制MCF-7細(xì)胞的Nrf2表達(dá)、誘導(dǎo)凋亡是通過(guò)誘發(fā)ERS完成，ERS在這一過(guò)程起核心調(diào)控作用，這為BRU抑制Nrf2表達(dá)的機(jī)制研究提供了依據(jù)。此外，與傳統(tǒng)抗癌藥物相比，較低劑量BRU可顯著促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡，具有一定的劑量?jī)?yōu)勢(shì)。

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（收稿日期：2018-09-13）

（修回日期：2018-10-27;編輯：華強(qiáng)）