(河北中醫(yī)學(xué)院，石家莊 050200)

北沙參為安國八大祁藥之一，為傘形科植物珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的根。北沙參味甘甜，是臨床常用的滋陰藥，養(yǎng)陰清肺，祛痰止咳，主治肺燥干咳、熱病傷津、口渴等癥[1]，為河北省的道地藥材，每年全國需求量在5 000 t左右，是一個(gè)大宗藥材品種。

注：A為ck(BK培養(yǎng)基)；B為TTC染色；C為I2-KI 染色；D為亞甲基藍(lán)染色。圖1 花粉的活性檢測

近年來，野生北沙參的資源已經(jīng)無法滿足市場需要，市場上主要是人工栽培品種。對(duì)北沙參的研究主要集中在栽培條件[2]和藥理藥效研究[3-4]，對(duì)于北沙參的優(yōu)良品種選育研究的較少。傘形科植物柴胡[5-6]、防風(fēng)[7]、明黨參[8]、當(dāng)歸[9]和阿魏[10]的花粉研究已經(jīng)有報(bào)導(dǎo)，并通過對(duì)花粉的研究進(jìn)一步對(duì)上述藥材進(jìn)行良種選育，但北沙參的花粉研究還未見報(bào)道。因此，本文通過研究北沙參的花粉活性及貯存條件，觀察北沙參花粉的形態(tài)特征，為北沙參的良種選育奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

樣品采自河北中醫(yī)學(xué)院藥用植物園，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院鄭玉光教授鑒定為珊瑚菜(GlehnialittoralisFr. Schmidt ex Miq.)，選擇盛花期的枝條作為實(shí)驗(yàn)材料。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 花粉活性檢測

采用TTC法、I2-KI 染色法、亞甲基藍(lán)染色法和離體萌發(fā)法檢測花粉活性。TTC法和I2-KI 染色法參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》第四版[11]的方法進(jìn)行，亞甲基藍(lán)染色法參照宮麗婷等[12]方法進(jìn)行。染色后，在10倍顯微鏡下觀察，每張裝片統(tǒng)計(jì)100個(gè)，重復(fù)3次。

離體萌發(fā)采用瓊脂培養(yǎng)，其中蔗糖分?jǐn)?shù)、硼酸及氯化鈣的濃度均參照劉保才等[13]的方法進(jìn)行，篩選出最適于北沙參花粉萌發(fā)的培養(yǎng)基配比。將花粉均勻抖落在凹面載玻片的培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，利用10倍顯微鏡進(jìn)行觀察，每張載玻片統(tǒng)計(jì)100個(gè)，重復(fù)3次。

2.2 貯藏溫度和時(shí)間的篩選

在北沙參的盛花期采摘其花序，輕輕的將花序放入牛皮紙袋內(nèi)，分別置于常溫(室溫)、低溫(4 ℃)和冷凍(-20 ℃)條件下貯藏。每天10：00時(shí)取樣，將花粉抖落在瓊脂培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分為2.1中篩選出的最適于北沙參離體萌發(fā)的成分配比)，于25 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)12 h，然后進(jìn)行花粉萌發(fā)的觀察和統(tǒng)計(jì)，連續(xù)觀察統(tǒng)計(jì)10 d。

2.3 貯藏濕度和時(shí)間的篩選

根據(jù)2.2的實(shí)驗(yàn)方法篩選出最適于北沙參貯藏的溫度，將盛花期新鮮的北沙參花序的花粉抖落于相對(duì)濕度為15%、32%、52%、66%、81%、95%的密閉盒子的固體培養(yǎng)基上(培養(yǎng)基成分為2.1中篩選出的最適宜北沙參離體萌發(fā)的成分配比)，黑暗培養(yǎng)12 h后觀察統(tǒng)計(jì)花粉的萌發(fā)率，連續(xù)觀察15 d。

表1 不同鹽類在25 ℃密封中的相對(duì)濕度[14]

鹽相對(duì)濕度/%LiCl·H2O15CaCl2·2H2O32NaHSO4·H2O52NaNO266(NH4)2SO481Na2HPO4·12H2O95

2.4 花粉形態(tài)特征觀察

將盛花期的北沙參花序的花粉輕輕彈落在載物銅臺(tái)的導(dǎo)電雙面膠上，放入JEOL JFC-1600中噴射鍍金，然后置于JSM-6390 LV掃描電鏡下觀察。選擇不同的視野觀察北沙參花粉的群體、個(gè)體和花粉表面紋飾。測量20個(gè)具有代表性的花粉粒的極軸長和赤道軸長，計(jì)算極赤比，同時(shí)測量其萌發(fā)溝的溝寬和溝長，觀察萌發(fā)溝的形態(tài)。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

利用Excel 2010軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，利用Photoshop 7.0軟件處理圖片。

注：A為BK培養(yǎng)基；B為第11組培養(yǎng)基。圖2 花粉的離體培養(yǎng)

表2 離體培養(yǎng)各培養(yǎng)基的組分和花粉萌發(fā)率

處理 各處理的組分 萌發(fā)率/% 蔗糖/%硼酸/(mg·mL-1)氯化鈣/(mg·mL-1)重復(fù)1重復(fù)2重復(fù)3平均值F值Pr>F多重比較1組00.000.0051.645.453.050.096.436<0.0001CD2組00.100.1027.028.021.125.4F3組50.100.1037.848.650.245.5CD4組100.000.1054.459.046.753.4C5組100.050.1041.444.745.643.9DE6組100.100.1054.441.339.645.1DE7組100.200.1052.757.562.557.6BC8組100.100.0042.143.735.940.57DE9組100.100.0541.138.249.342.9DE10組100.100.2038.739.632.937.1E11組200.100.1073.364.780.872.9A12組50.050.1039.030.032.133.7EF13組50.100.0569.854.065.062.9B14組100.050.0523.420.625.023FBK組10.10.03610.74.06.9G

注：不同字母表示差異顯著p<0.01。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 花粉的活性檢測

分別用TTC法、I2-KI 染色法和亞甲基藍(lán)染色法對(duì)花粉粒進(jìn)行染色觀察，結(jié)果表明，TTC不能將北沙參的花粉染成紅色(圖1 A)，用I2-KI對(duì)北沙參花粉粒進(jìn)行染色，全部花粉粒都呈現(xiàn)黃色(圖1 B)，利用亞甲基藍(lán)對(duì)北沙參花粉粒進(jìn)行染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)96%的花粉都被染成了藍(lán)色或淺藍(lán)色(圖1 C)，說明亞甲基藍(lán)染色法可以檢測北沙參花粉活性，而TTC法和I2-KI 染色法不適合檢測北沙參花粉?；钚浴?/p>

3.2 花粉的離體培養(yǎng)

根據(jù)劉保財(cái)?shù)萚13]的花粉離體萌發(fā)

的最適條件的篩選方法，篩選出最適合北沙參花粉萌發(fā)的蔗糖、硼酸和氯化鈣的配比：20%蔗糖+0.1% mg·mL-1硼酸+0.1% mg·mL-1氯化鈣，萌發(fā)率可達(dá)72.9%(圖2 B，表2)。

3.3 貯藏時(shí)間和溫度對(duì)花粉活性的影響

在冷凍、低溫或室溫條件下，北沙參花粉的萌發(fā)率隨著貯藏時(shí)間的延長而下降。在室溫下保存的北沙參花粉的萌發(fā)率一直高于冷凍和低溫貯藏的花粉，冷凍貯藏的花粉萌發(fā)率最低且下降最快。這可能是因?yàn)楸鄙硡⒌氖⒒ㄆ跒楸狈降?月份，當(dāng)時(shí)的氣候條件較適于花粉的存儲(chǔ)，同時(shí)由于采集并保存的是北沙參的花序，因此北沙參的花粉在常溫下一直保持較好的活性。而低溫和冷凍使北沙參花粉經(jīng)歷了一個(gè)冷害的過程，從而使其萌發(fā)率降低。

圖3 不同貯藏方法和時(shí)間對(duì)北沙參花粉?；钚缘挠绊?/p>

注：A為花粉粒極面觀；B為花粉粒赤面觀；C為花粉粒表面網(wǎng)孔；D為花粉粒萌發(fā)溝；E為花粉粒群體；F為將要萌發(fā)的花粉粒。圖5 北沙參花粉粒的形態(tài)特征觀察

3.4 貯藏時(shí)間和濕度對(duì)花粉活性的影響

由3.3的結(jié)果可知，隨著花粉貯藏時(shí)間的延長其生活力逐漸下降，只有在室溫大約25 ℃的情況下，北沙參的花粉才能夠在貯藏1 d后保持60%左右的萌發(fā)率。因此，選擇室溫下貯藏的北沙參花粉，將其置于不同濕度的環(huán)境中進(jìn)行萌發(fā)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)貯藏1 d的花粉由于不同的濕度呈現(xiàn)出不同的萌發(fā)率，在濕度15%～52%的情況下花粉的萌發(fā)率能夠達(dá)到70%以上，但是濕度達(dá)到60%以上后，花粉的萌發(fā)率只有50%左右。隨著貯藏時(shí)間的延長，各濕度情況下花粉的萌發(fā)率都在逐漸降低，而濕度超過60%以后，花粉的萌發(fā)率明顯降低。這說明北沙參的最適花粉萌發(fā)濕度在15%～52%之間，大于這一濕度的環(huán)境會(huì)導(dǎo)致花粉萌發(fā)的減少。

圖4 不同貯藏濕度對(duì)北沙參花粉?；钚缘挠绊?/p>

3.5 北沙參花粉形態(tài)特征觀察

通過電鏡掃描觀察，北沙參的花粉赤道面觀為超長方形，極面觀為三角形。極軸長為38.5～44.5μm，赤軸長為12.1～15.0μm，極赤比為3.20；具有3個(gè)萌發(fā)溝，溝長為24.5～31.3μm，溝寬為3.09～7.04μm；花粉粒表面是縱橫交錯(cuò)的網(wǎng)狀紋飾，其間具有一些大小不均的小孔(圖5 C)。在盛花期，花粉粒大部分發(fā)育良好(圖5 E)。收集盛花期后的花粉粒觀察會(huì)發(fā)現(xiàn)部分花粉粒有要萌發(fā)的跡象，或者說為萌發(fā)做好了準(zhǔn)備(圖5 F)。

4 討 論

常用的花粉測定方法有TTC法、I2-KI 染色法、離體培養(yǎng)法等，亞甲基藍(lán)法并不常用于花粉活性測定。利用TTC法和I2-KI 染色法都不能很好的反映北沙參花粉的活性，這與防風(fēng)花粉活力測定的結(jié)果相同[13]，而亞甲基藍(lán)染色可以使北沙參花粉呈現(xiàn)藍(lán)色、淺藍(lán)色等，可以很好的區(qū)分花粉是否有活性。但是，利用亞甲基藍(lán)染色會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏高，這在多種植物的花粉活性測定中都呈現(xiàn)這一現(xiàn)象[15-16]。

北沙參花粉的萌發(fā)未見明顯伸長的花粉管。觀察在25 ℃培養(yǎng)24 h，48 h甚至72 h的花粉粒，萌發(fā)的北沙參花粉粒只是在花粉的中部出現(xiàn)一個(gè)凸起，并未形成長的花粉管，這與傘形科防風(fēng)的花粉管形態(tài)相似，而且防風(fēng)的花粉粒形態(tài)也同北沙參相似為超長橢圓形。

大多數(shù)植物的花粉在低溫或超低溫保存的情況下其活性都較室溫或冷凍的花粉活性高[13,17]，但是貯藏在室溫的北沙參花粉的萌發(fā)率高于低溫及冷凍的花粉，這可能是因?yàn)楸鄙硡⒌幕ǚ凼⒒ㄆ谠诒狈降?月份，此時(shí)的天氣干燥溫暖，濕度較低，很適合北沙參花粉的保存。而低溫以及冷凍的環(huán)境條件下，濕度相對(duì)較大，使北沙參的花粉經(jīng)歷了一個(gè)凍害的過程，從而導(dǎo)致其生活力下降。 由于低溫環(huán)境下北沙參的花粉活性就開始下降，因此未利用超低溫來保存北沙參的花粉，北沙參的花粉是否適于超低溫保存需要進(jìn)一步研究。

傘形科花粉形態(tài)共有6種，即近菱形、近圓形、橢圓形、近長方形、超長方形和赤道收縮形[18]。北沙參花粉形態(tài)為超長方形，極面觀為三角形，具有3個(gè)萌發(fā)溝，表面具有錯(cuò)綜復(fù)雜的紋飾，與傘形科防風(fēng)的花粉粒相似，但比防風(fēng)的花粉粒更長，與傘形科棱子芹屬太白棱子芹的花粉外形相似[19]。在所有已知的傘形科各屬的花粉特征差別較大，即使同一屬花粉的外形、極面觀和表面紋飾也不盡相同，這可能與花粉的活性及萌發(fā)特性相關(guān)。因此北沙參不同類群之間花粉的差別以及其在良種選育中的作用將有待于進(jìn)一步研究。