喬改霞 陳建偉 王翠平 嚴(yán)莉 李健

摘要：以改進(jìn)CTAB法對(duì)玉皇李和未鑒定新品種葉片基因組DNA的提取進(jìn)行了試驗(yàn)。結(jié)果表明，該方法從這2個(gè)品種李樹葉片中均能提出基因組總DNA，且DNA的純度和完整性均較好，OD260/OD280的比值在1.8-2.0之間，無降解現(xiàn)象，PNA去除干凈;此外，運(yùn)用RAPD標(biāo)記方法對(duì)這2個(gè)李品種基因組總DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其PAPD分析條帶清晰，用20條隨機(jī)引物共擴(kuò)增出114條帶，平均每條引物擴(kuò)增出5.7條條帶，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200～2000bp，其中P6、P7、P10、P14和P16 5條隨機(jī)引物可以單引物區(qū)分這2個(gè)品種，共獲得20個(gè)條帶，其中差異條帶有6個(gè)，表明這6個(gè)位點(diǎn)存在差異。因RAPD每條擴(kuò)增譜帶對(duì)應(yīng)基因組DNA分子上的一個(gè)位點(diǎn)，說明供試品種間DNA位點(diǎn)存在差異，表明未鑒定新品種在栽培過程中發(fā)生突變和分化，可能是1個(gè)優(yōu)良種源。

關(guān)鍵詞：李;成熟葉片;DNA提取;RAPD

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)以其簡(jiǎn)單、快捷、實(shí)用等優(yōu)勢(shì)而成為植物遺傳育種領(lǐng)域研究的有力工具之一，RFLP（restriction fragment length polymor-phism）、RAPD（random amplified polymorphic DNA）、AFLP（amplified fragment length polymorphism）和SSR（simple sequence repeats）等多種分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多種植物的遺傳多樣性、親緣關(guān)系、遺傳圖譜構(gòu)建及進(jìn)行分子輔助育種等多方面的研究，而制備高質(zhì)量的DNA是進(jìn)行分子標(biāo)記的基礎(chǔ)。植物DNA的提取方法很多，但如何在這些技術(shù)操作過程中獲得高質(zhì)量DNA樣品是廣大生物技術(shù)工作者關(guān)心的問題。

不同植物或同種植物的不同組織具有其各自的特點(diǎn)，其次生代謝產(chǎn)物的種類和含量差異很大，所以很難用一種方法來提取不同植物的DNA。果樹成熟葉片中多糖、多酚和其他生物質(zhì)含量較高，提取高質(zhì)量的基因組DNA具有一定的難度，原因是在提取DNA過程中多糖及酚類去除不徹底，與DNA共沉淀，呈黏稠的膠狀物而難以溶解，而且多糖及酚類物質(zhì)會(huì)嚴(yán)重抑制Taq DNA聚合酶的活性而影響擴(kuò)增的效果。李屬植物（prunus L.）葉片基因組DNA的提取已有一些研究，我們最初參照這些方法提取玉皇李和未鑒定新品種葉片基因組DNA，但提取的效果均不甚理想。為此，在預(yù)備實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們對(duì)植物基因組DNA提取方法進(jìn)行了適當(dāng)改良以滿足小批量DNA提取的需要，通過RAPD擴(kuò)增獲得了適宜于RAPD擴(kuò)增的中國(guó)李基因組DNA的方法。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)是直接利用植物DNA分子水平上的差異來進(jìn)行鑒別，其結(jié)果不受環(huán)境和地理因素的影響，更加準(zhǔn)確、可靠。目前應(yīng)用較為廣泛的DNA分子標(biāo)記技術(shù)是RAPD技術(shù)。RAPD技術(shù)是一種使用隨機(jī)引物快速反映DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于遺傳多樣性、近緣關(guān)系、品種鑒別等的研究中。Khadivi等應(yīng)用RAPD標(biāo)記并結(jié)合形態(tài)學(xué)標(biāo)記對(duì)28個(gè)伊朗本土甜櫻桃和11個(gè)國(guó)外甜櫻桃品種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，表明品種之間存在著高度的遺傳變異。Boonpra-kob等用RAPD多態(tài)性標(biāo)記分別對(duì)加利福尼亞州和美國(guó)東南地區(qū)的日本李和中國(guó)李、歐洲李以及美國(guó)本土雜交李品種親緣關(guān)系進(jìn)行分析。Lu等舊用6個(gè)RAPD引物就區(qū)分了18個(gè)桃砧木品種，聚類分析結(jié)果與以前系譜分析完全吻合，證明RAlPD技術(shù)能夠進(jìn)行桃品種鑒定。

本試驗(yàn)中運(yùn)用RAPD標(biāo)記方法對(duì)2個(gè)李品種基因組總DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其RAPD分析條帶清晰，用20條隨機(jī)引物共擴(kuò)增出114條帶，平均每條引物擴(kuò)增出5.7條條帶，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200～2000bp。20條隨機(jī)引物中有5條可以單引物區(qū)分這2個(gè)品種，其中差異條帶有6個(gè)（表3），表明這6個(gè)位點(diǎn)存在差異。這有效地區(qū)分這2種品種，因RAPD每一條擴(kuò)增譜帶對(duì)應(yīng)基因組DNA分子上的一個(gè)位點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果說明供試品種間DNA位點(diǎn)存在差異，這表明未鑒定新品種在栽培過程中發(fā)生突變和分化，可能是1個(gè)優(yōu)良種源。

1材料和方法

1.1材料

試驗(yàn)李品種為玉皇李和未鑒定新品種。這些品種的葉片采于寧夏吳忠。取秋季老葉，用清水沖洗吸干后置于-80℃冰箱中貯藏備用。

2.2完整性檢測(cè)

改進(jìn)CTAB法提取的DNA呈無色透明的絮狀沉淀，DNA樣液瓊脂糖凝膠電泳分析圖譜見圖1，從中可以看出2種品種的李子成熟葉片均提出了較完整的基因組DNA，無RNA污染，也未發(fā)生明顯降解現(xiàn)象，適合RAPD擴(kuò)增分析。

2.3基因組DNA的RAPD擴(kuò)增結(jié)果

為驗(yàn)證提取DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增的適用性，用該法共提取了2個(gè)中國(guó)李品種基因組DNA樣品用于PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果電泳圖譜見圖2。從圖2中可以看出，除了2對(duì)引物，2個(gè)樣品均有較清晰的擴(kuò)增產(chǎn)物，說明改良后CTAB法提取的玉皇李和未鑒定新品種葉片基因組DNA能滿足RAPD分子標(biāo)記研究的需求。

此外，瓊脂糖凝膠電泳統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，20條引物在2個(gè)品種中共擴(kuò)增出114條帶，平均每條引物擴(kuò)增出5.7條條帶，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200～2000bp。其中P6、P7、P10、P14、和P18 5條隨機(jī)引物可以單引物區(qū)分這2個(gè)品種，共獲得20個(gè)條帶，其中差異條帶有6個(gè)（表3），表明這6個(gè)位點(diǎn)存在差異。因RAPD每一條擴(kuò)增譜帶對(duì)應(yīng)基因組DNA分子上的一個(gè)位點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果說明，供試品種間DNA位點(diǎn)存在差異，這表明未鑒定新品種在栽培過程中發(fā)生突變和分化，可能是1個(gè)優(yōu)良種源。

3討論

在成熟的李葉片中多糖及酚類等次生物質(zhì)含量較高，提取高質(zhì)量的基因組DNA具有一定的難度。在本實(shí)驗(yàn)初期，我們?cè)糜窕世畛墒烊~片DNA提取方法，但提取的DNA沉淀呈黏稠狀，難以溶解于TE溶液中，且多糖類雜質(zhì)裹挾著DNA，在去除多糖類物質(zhì)時(shí)同時(shí)也將基因組DNA去除。電泳時(shí)DNA由于被多糖類雜質(zhì)包裹而常常聚集在點(diǎn)樣孔處，這造成點(diǎn)樣孔擠壓成圓弧形，點(diǎn)樣孔處的亮度遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于DNA帶。

CTAB法被認(rèn)為是從多糖類含量高的植物中提取DNA較理想的方法，因?yàn)樵诟唠x子強(qiáng)度溶液中，CTAB能與蛋白質(zhì)及大多數(shù)酸性多糖以外的多聚糖形成復(fù)合物，而不能沉淀核酸。為了有效地去除多糖和多酚類等物質(zhì)的干擾，我們?cè)诖朔椒ǖ幕A(chǔ)上又做了進(jìn)一步的改進(jìn)：①用CTAB-free有效除去多糖及酚類物質(zhì)，然后再用裂解緩沖液裂解細(xì)胞核使DNA釋放出來，利用CTAB在高離子強(qiáng)度的溶液里（>0.7 mol/L NaCl），易與蛋白質(zhì)和大多數(shù)多糖形成復(fù)合物，及0.7 mol/L的NaCl對(duì)多糖類物質(zhì)的溶解作用，進(jìn)一步降低了多糖類等雜質(zhì)對(duì)DNA提取的影響;②CTAB裂解液和提取緩沖液中的5%β-巰基乙醇對(duì)酚類物質(zhì)氧化的抑制作用，再加上提取緩沖液中3%的可溶性PVP與酚類物質(zhì)的結(jié)合作用，也有效地去除了多酚類物質(zhì)對(duì)DNA提取的干擾;③在氯仿/異戊醇（24：1）及酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）抽提過程中加入的1/10體積CTAB/NaCl溶液，進(jìn)一步降低了多糖類物質(zhì)對(duì)DNA提取的影響;④在氯仿/異戊醇（24：1）抽提后的水相中加入1/2體積5mol/L的NaCl溶液，可使殘留的多糖類等物質(zhì)充分溶解，隨后加入的乙醇，可選擇性沉淀DNA，達(dá)到了分離純化DNA的目的。

RAPD具有操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，對(duì)工作人員危害少，標(biāo)記數(shù)量多，可以覆蓋整個(gè)基因組等特點(diǎn)，且不受季節(jié)、組織及環(huán)境的限制等特點(diǎn)，在果樹的分類研究、基因連鎖標(biāo)記、遺傳圖譜的構(gòu)建等方面得到了廣泛的應(yīng)用。初建青等對(duì)李RAPD擴(kuò)增片段進(jìn)行分析，研究表明，RAPD不僅能擴(kuò)增基因組上的非蛋白編碼序列，而且還可以擴(kuò)增編碼蛋白的基因片段，是能夠較全面反映基因組序列信息理想的DNA標(biāo)記技術(shù)。喬玉山等以奉化李為試材，對(duì)中國(guó)李RAPD反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，利用該優(yōu)化反應(yīng)體系，用10個(gè)隨機(jī)引物，構(gòu)建了5個(gè)中國(guó)李品種的RAPD指紋圖譜，并以共有譜帶率對(duì)這些品種遺傳關(guān)系進(jìn)行了分析;吉前華利用梯度PCR優(yōu)化了RAPD反應(yīng)條件，建立了RAPD-PCR分析的最佳反應(yīng)體系，顯著提高了柑桔RAPD分析的特異性、效率和穩(wěn)定性。這些表明，RAPD分析是品種鑒定研究的簡(jiǎn)單實(shí)用的方法。

文中運(yùn)用RAPD標(biāo)記方法對(duì)2個(gè)李品種基因組總DNA進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，其RAPD分析條帶清晰，用20條隨機(jī)引物共擴(kuò)增出114條帶，平均每條引物擴(kuò)增出5.7條條帶，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為200～2000bp。20條隨機(jī)引物中有5條可以單引物區(qū)分這2個(gè)品種，其中差異條帶有6個(gè)（表3），表明這6個(gè)位點(diǎn)存在差異，可以說RAPD標(biāo)記是鑒定和區(qū)分中國(guó)李品種的有效手段，進(jìn)一步證實(shí)了RAPD標(biāo)記技術(shù)鑒定果樹品種的可行性。因RAPD每一條擴(kuò)增譜帶對(duì)應(yīng)基因組DNA分子上的一個(gè)位點(diǎn)，試驗(yàn)結(jié)果說明供試品種間DNA位點(diǎn)差異較多，從分子水平上初步證明這2種李品種在基因組上的差異性，這可能是在栽培過程中未鑒定新品種在栽培過程中發(fā)生突變和分化，可能是1個(gè)優(yōu)良種源，這為優(yōu)良品種選育提供理論支持。