摘 要： 以辣椒尾孢霉（Cercospora capsici Heald. et Wolf.）為供試菌，采用分光光度計測定辣椒尾孢霉產(chǎn)生的細胞壁降解酶種類;通過電導(dǎo)率測定及透射電鏡觀察以探索細胞壁降解酶的致病作用。結(jié)果表明，辣椒尾孢霉在活體內(nèi)外均可產(chǎn)生多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）、多聚半乳糖醛酸反式消除酶（PGTE）、果膠甲基反式消除酶（PMTE） 和羧甲基纖維素酶（Cx） 等細胞壁降解酶，而β-葡萄糖苷酶只在活體外產(chǎn)生，且該菌在活體內(nèi)和活體外產(chǎn)生的細胞壁降解酶活性差異較大。透射電鏡觀察結(jié)果表明，細胞壁降解酶對葉片的超微結(jié)構(gòu)有破壞作用，病菌細胞壁降解酶在致病過程中能夠損傷寄主的細胞膜，從而影響其透性;就細胞膜損傷率而言，混合酶的作用顯著高于單一酶，果膠酶對細胞膜的損傷明顯強于纖維素酶。

關(guān)鍵詞： 辣椒; 辣椒尾孢霉; 細胞壁降解酶; 致病機制

The role of cell wall degrading enzymes in the pathogenic process of pepper brown leaf spot disease caused by Cercospora capsici

SUN Jun

（Liaoning Institute of Economic Forestry， Dalian 116031， Liaoning， China）

Abstract： The species of cell wall degradation enzyme （CWDE） produced by Cercospora capsici was determined by spectrophotometer. The cell wall degradation enzyme involved in pathogenicity was observed by measuring electrical conductivity and transmission electron microscopy. It showed that Cercospora capsici can produce polygalacturonase（PG）， polymethyl- galacturonase（PMG）， polygalacturonic acid trans- eliminase （PGTE ）， pectin methyl trans-eliminase （PMTE） and carboxymethyl cellulase （Cx） both in vitro and in vivo， while β-glucosidase was only found in vitro.The cell wall degradation enzyme （CWDE） produced by Cercospora capsici were different between in vivo and in vitro.The results of transmission electron microscopy showed that the cell wall degradation enzyme damaged to the ultrastructure of the leaves.The host cell membrane can be damaged during the pathogenic process， thus affecting its permeability. In terms of cell membrane injury rate， the effect of mixed enzyme was significantly higher than that of single enzyme， and pectinase was significantly stronger than cellulase.

Key words：Pepper;Cercospora capsici; Cell wall degrading enzymes; Pathogenic mechanism

辣椒褐斑病為遼寧地區(qū)蔬菜生產(chǎn)上的新病害，致病菌為辣椒尾孢霉（Cercospora capsici Heald. et Wolf.），主要危害葉片，嚴重時病斑相連成不規(guī)則的大斑，后期病組織干枯壞死，呈掙裂狀穿孔，致使葉片支離破碎，嚴重時病葉變黃脫落[1]。目前，對于辣椒褐斑病的報道僅限于癥狀描述及病原菌的鑒定，其致病機制尚不明確。植物病原菌在與寄主相互識別的過程中可產(chǎn)生一系列細胞壁降解酶，降解植物組織以提供營養(yǎng)并促進其對寄主組織的入侵[2-3]。因此，細胞壁降解酶是植物病原真菌的重要致病因子[4-5]。了解細胞壁降解酶在尾孢霉致病機制中的作用，對進一步有針對性地控制病害具有重要意義。植物病原菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶對寄主植物的傷害往往是果膠酶和纖維素酶共同作用完成的。陳曉林等[6]發(fā)現(xiàn)，蘋果樹腐爛病菌Valsa ceratosperma在活體組織內(nèi)、外均能分泌一系列的細胞壁降解酶——多聚半乳糖醛酸酶（PG）、果膠甲基半乳糖醛酸酶（PMG）、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶和木聚糖酶。趙景楠等[7]研究了草莓褐色葉斑病菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶的種類、培養(yǎng)條件及致病機制，證明其在該病原菌的致病過程中起重要作用。車喜慶等[8]為了明確人參不同部位對人參核盤菌的敏感性，在溫室分別對人參蘆頭部和須根部接種病菌，觀察不同部位發(fā)病情況，并對人參不同部位細胞壁降解酶活性及寄主防御酶活性進行測定。

由于病菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶是病菌侵入寄主的主要手段之一，因此明確辣椒褐斑病菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶種類及活性，對深入研究其致病機制具有重要意義。鑒于此，筆者研究了辣椒褐斑病菌產(chǎn)生的細胞壁酶種類及活性，進一步闡明辣椒褐斑病菌的致病機制，旨在為闡明病菌生長與環(huán)境條件的關(guān)系以及進一步探討病害的發(fā)病規(guī)律及防治方法提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞壁降解酶的提取與純化

試驗于2014年7月在沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物病理真菌實驗室和儀器分析中心進行。按Papavizas和Ayers的方法將分離純化的辣椒尾孢菌（Cercospora capsici）在Marcus[9]或Richard細胞壁降解酶誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)。病菌培養(yǎng)9 d及15 d 后，過濾除去菌絲和孢子，在4 ℃下10 000 r·min-1離心15 min，上清液即為酶粗提液。向酶粗提液中加入硫酸銨到60%飽和度（25 ℃），在4 ℃下先靜置5 h后再以10 000 r·min-1離心15min，棄上清液，用50 mmol·L-1醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH 5.0）分別溶解沉淀。沉淀在同樣的緩沖液中于4 ℃下透析2 d，每12 h換1次透析液，純化的酶在-20 ℃下保存?zhèn)溆?。分離純化的辣椒尾孢菌菌株在PSA上培養(yǎng)25 d后，打取菌片接種到辣椒葉片上，置于人工氣候箱中高濕培養(yǎng)，取樣并提純[10]，以未接種的辣椒葉片作對照。

1.2 細胞壁降解酶活性的測定

參照張紅、吳潔云等 [11-12]的方法采用紫外-可見光分光光度計法測定細胞壁降解酶的活性。

1.3 辣椒褐斑病菌細胞壁降解酶致病作用

1.3.1 對辣椒葉片作用的觀察 選取4～5葉期辣椒葉片（‘沈椒4號），針刺葉片造成傷口，分別將浸有純化的病菌細胞壁降解酶和經(jīng)高溫（121 ℃）處理后的病菌細胞壁降解酶的脫脂棉覆蓋在傷口上，置于28～30 ℃下培養(yǎng)并保濕，24 h后觀察葉片的病變情況并拍照，以蒸餾水處理作對照。

1.3.2 對辣椒葉片細胞膜損傷的測定 將辣椒葉片用直徑5 mm的打孔器制成若干塊，以去離子水沖洗晾干，置于分別裝有5 mL酶液的PC管中，減壓抽氣使葉片沉入酶液中，處理后測定葉片組織浸出液的電導(dǎo)率[11-12]。

1.3.3 對辣椒葉片細胞超微結(jié)構(gòu)破壞的觀察 切取辣椒葉片2 mm組織塊若干，分別浸入裝有酶液的PC管中，取樣，脫水。用JEM-1200EX（JEOL日本電子）透射電子顯微鏡觀察組織結(jié)構(gòu)的變化。對照用滅菌水處理36 h [11-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病菌在活體內(nèi)外產(chǎn)生細胞壁降解酶的種類及活性

辣椒尾孢菌在活體內(nèi)外均能產(chǎn)PG、PMG、PGTE、PMTE和Cx，而β-葡萄糖苷酶只在活體外產(chǎn)生，在活體內(nèi)不產(chǎn)生。該病菌在活體外產(chǎn)生細胞壁降解酶的活性依次為β-葡萄糖苷酶、Cx、PMTE、PMG、PGTE和PG;在活體內(nèi)產(chǎn)生細胞壁降解酶的活性依次為Cx、PG、PMG、PMTE和PGTE。產(chǎn)生的纖維素酶活性高于果膠酶。除Cx外，其余5種細胞壁降解酶活體外的產(chǎn)生量均高于活體內(nèi)。結(jié)果還表明，接種病菌后，病組織內(nèi)各種細胞壁降解酶的活性明顯高于未接種的健康對照植株（表1）。

表1 辣椒尾孢霉活體內(nèi)外產(chǎn)生

細胞壁降解酶的種類及活性

[酶活性/

（U·mg-1） 細胞壁降解酶 PG PMG PGTE PMTE Cx β-glucosidase 活體外 5.22 15.18 9.17 18.83 20.1 25.21 活體內(nèi) 4.3 4.12 2.91 3.72 46.77 0.00 對照 0.49 0.32 0.19 0.26 3.14 0.00 ]

2.2 辣椒褐斑病菌細胞壁降解酶的致病作用

由圖1可以看出，細胞壁降解酶處理的辣椒葉片出現(xiàn)了不同程度的水漬狀病斑和黃色斑塊，而酶液經(jīng)高溫（121 ℃）處理后則未能侵害葉片。病菌接種后的葉片褐化嚴重，病斑近圓形，而酶液處理葉片以黃化為主。果膠酶和混合酶對葉片的破壞作用較大。

2.3 對辣椒葉片細胞膜損傷的測定

由表2可知，辣椒褐斑病菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶對辣椒葉片細胞膜有明顯的損傷作用?；旌厦傅淖饔脴O顯著高于單一酶，細胞膜損傷率最大，達到51.33%;果膠酶對細胞膜的損傷極顯著強于纖維素酶。（注：纖維素酶Cx活性為21.10 U·mg-1;果膠酶PMG活性為15.18 U·mg-1）

2.4 對辣椒葉片細胞超微結(jié)構(gòu)破壞的觀察

如圖2-A所示，對照葉片細胞超微結(jié)構(gòu)中細胞壁結(jié)構(gòu)完整，葉綠體膜結(jié)構(gòu)完整，片層結(jié)構(gòu)清晰、排列有序。纖維素酶處理36 h后，葉片細胞葉綠體脫落，葉綠體膜消解，線粒體膜模糊（圖2-B），用果膠酶處理的葉片，超微結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，細胞壁結(jié)構(gòu)受損、消解，細胞膜破裂，內(nèi)含物外泄，葉綠體膜破裂，基粒片層模糊，線粒體膜受損，內(nèi)含物外泄，線粒體嵴模糊、消失（圖2-C）。比較果膠酶與纖維素酶對葉片細胞的破壞作用，果膠酶消解細胞內(nèi)含物的作用更強?；旌厦柑幚砣~片后，細胞壁變形扭曲、變薄，線粒體嵴消失，線粒體膜模糊，細胞內(nèi)細胞器消失，葉綠體膜消解，基粒片層結(jié)構(gòu)崩解（圖2-D）。

3 討論與結(jié)論

辣椒尾孢菌在活體內(nèi)、外均能產(chǎn)PG、PMG、PGTE、PMTE和Cx，而β-葡萄糖苷酶只在活體外產(chǎn)生，在活體內(nèi)不產(chǎn)生，且該菌在活體內(nèi)和活體外產(chǎn)生的細胞壁降解酶活性差異較大，這可能是由于活體內(nèi)和活體外環(huán)境因素不同，導(dǎo)致酶活性差異較大?；铙w外酶活性分析時，應(yīng)多考慮溫度、pH值、底物濃度等對酶活性的影響，但活體內(nèi)產(chǎn)生的酶接近自然發(fā)病情況，具有實際研究意義。研究發(fā)現(xiàn)，PGTE和PMTE培養(yǎng)9 d時活性最高，而PG 、PMG、Cx和β-葡萄糖苷酶培養(yǎng)15 d時活性最高，因此PGTE和PMTE在培養(yǎng)9 d測定，而PG、PMG、Cx和β-葡萄糖苷酶在培養(yǎng)15 d測定;PMG活體外培養(yǎng)基選用的是Richard培養(yǎng)液，其他酶選用改良的Marcus培養(yǎng)液[13]。

細胞壁降解酶處理的辣椒葉片出現(xiàn)不同程度的水漬狀病斑和黃色斑塊，而酶液經(jīng)高溫（121 ℃）處理后則失去對葉片的侵害作用，酶液處理的葉片與病菌接種的葉片癥狀相似。由此推測，細胞壁降解酶是該病原菌致病因子之一。果膠酶、纖維素酶以及兩者的混合酶液，可使葉片出現(xiàn)明顯病斑，其中以果膠酶和混合酶對葉片的破壞作用較大。在葉片沒有傷口的情況下，酶液處理后產(chǎn)生的癥狀較輕，但在葉片有傷口的情況下用酶液處理，則產(chǎn)生明顯黃化和水漬狀病斑，這與金勤等[14]的研究結(jié)果一致。同樣楊媚等[15]研究認為，通過酶處理葉片后發(fā)現(xiàn)，細胞壁降解酶確實對水稻葉片組織造成損傷，并且隨著酶濃度升高，損傷程度逐漸加重。

隨著電鏡技術(shù)的發(fā)展，很多學(xué)者更深入地研究了病原菌致病因子對寄主組織細胞的破壞。李寶聚等[16]通過透射電鏡和掃描電鏡觀察，指出果膠酶、纖維素酶可以造成植物細胞質(zhì)壁分離，還可造成葉綠體、線粒體內(nèi)部空泡化，液泡、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受損。研究證明，葉綠體膜、片層結(jié)構(gòu)主要被纖維素酶降解，線粒體膜主要被果膠酶降解。辣椒褐斑病菌產(chǎn)生的細胞壁降解酶對辣椒葉片細胞膜有明顯損傷作用。通過透射電鏡觀察，細胞壁降解酶對葉片的超微結(jié)構(gòu)有破壞作用。酶液能造成辣椒葉片細胞質(zhì)壁分離、細胞壁消解、細胞質(zhì)膜斷裂、葉綠體膜破裂、基粒片層模糊、線粒體膜受損、內(nèi)含物外泄甚至消失等現(xiàn)象，該結(jié)果與張紅[11]對立枯絲核菌細胞壁降解酶致病作用的研究結(jié)果一致。

提高寄主細胞壁抗降解酶能力可能是寄主抗褐斑病的有效途徑之一。由于辣椒尾孢菌可以產(chǎn)生一系列細胞壁降解酶，而且這幾種細胞壁降解酶是該菌的主要致病因子之一，因此增強寄主細胞壁抗降解酶能力是在生產(chǎn)中提高寄主抗病性的可行措施之一，可在今后的抗病育種過程中進一步深入研究。

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