馮 靜，石海仁，鵬 達(dá)，鄭曉彤，張 浩，馬雪英*

(1.西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，西藏 拉薩 850009；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100094)

拉薩白雞是以白來航雞為父本、河谷藏雞為母本雜交培育的良種蛋雞，屬輕型蛋用品系[1]。

顯性白羽基因座是影響雞羽色的一個重要基因座位，該基因座位上的顯性等位基因 I 對色素沉著，尤其是真黑色素的合成有抑制作用[2]。黑素小體是黑色素細(xì)胞和視黃醛色素上皮細(xì)胞中特殊的溶酶體相關(guān)的細(xì)胞器[3]。目前在該基因座共發(fā)現(xiàn)4種等位基因：I (顯性白羽)， I*S(Smoky，煙灰色羽色)，I*D (Dun，暗褐色羽色)，i(野生型)。Kerje等[4]對紅色原雞、白來航等不同品種雞的DNA的PMEL17基因序列的第10外顯子上的9 bp插入突變是顯性白羽性狀形成的主要原因，所對應(yīng)的等位基因?yàn)镮，而隱性等位基因i不含該突變，由此可見，雞的PMEL17基因編碼區(qū)的插入或缺失突變與這些等位基因形成有關(guān)。雞的PMEL17 基因包括12個外顯子，全長約 4.0 kb，共編碼約788個氨基酸(GenBank 登錄號：AY636127.1)。該基因編碼一種黑素細(xì)胞特異性蛋白，這種存在于前黑素體基質(zhì)中的蛋白對黑色素聚積以及黑素細(xì)胞的正常發(fā)育起著重要作用[5]。前黑素小體蛋白(Premelanosome protein，PMEL)又稱PMEL17、silver[6]，由Sliver基因編碼，主要在皮膚黑色素細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和眼色素層黑素細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)，是黑素小體發(fā)育過程中的重要物質(zhì)[7-8]。

關(guān)于拉薩白雞顯性白羽PMEL17第10外顯子序列突變的研究，目前尚未研究。本試驗(yàn)首次對拉薩白雞的顯性白羽基因PMEL17第10外顯子序列突變進(jìn)行了分析，為拉薩白雞今后的羽毛性狀的功能基因的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選用5世代22周齡的拉薩白雞228羽作為試驗(yàn)材料，其中花羽公雞8羽，花羽母雞36羽，白羽公雞71羽，白羽母雞113羽(表1)，是由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所蔡功堂鄉(xiāng)拉薩白雞養(yǎng)殖基地提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 血液采集和DNA的提取 采用翅靜脈采血1.5 ～2.0 mL，并且加入同等量的無水乙醇，混勻，常溫保存。利用DNA血液提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因組DNA，用NanoDrop 2000C超微量分光光度計檢測其核酸的濃度及其純度。

1.2.2 引物設(shè)計 根據(jù)雞的PMEL17 基因第10外顯子存在9 bp插入突變與顯性白羽基因有關(guān)，GenBank 登錄號：AY636127.1，設(shè)計引物：上游5’-AACGGCAACGGCTTGGCTGTGG-3’，下游5’-CCGGTAGGTGTAGGCAGCGGTG-3’[9]。

1.2.3 試驗(yàn)試劑及試驗(yàn)儀器 DNA血液提取試劑盒、Taq酶(配套10×TaqBuffer，25 mmol/L Mg2+)、dNTP均為天根生化科技(北京)有限公司；NanoDrop 2000C超微量分光光度計為美國(賽默飛)、DM2000 Marker為匯天東方科技有限公司；BsrB I內(nèi)切酶、2 mL 10×NEBuffer(內(nèi)切酶配套)為NEB公司；PCR儀為BIO-RAD；電泳儀為北京六一儀器廠；UVP凝膠成像儀為BIO-RAD。

表1 不同羽色的拉薩白雞數(shù)量

M：D2000，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11泳道為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物片段。片段長度為217 bp或226 bp圖1 拉薩白雞PMEL17 基因第10外顯子PCR的凝膠圖

1.2.4 PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件 PCR擴(kuò)增體系：反應(yīng)體積為20 μl，2×TaqPCR masterMix 10 μl，10 pmol/L上游引物0.3 μl，10 pmol/L下游引物0.3 μl，40～50 ng/μl DNA 1.0 μl，加超純水至20 μl。

PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變形5 min，95 ℃ 30 s，67 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸30 s，34個循環(huán)，72 ℃終延伸7 min，12 ℃保存，最終反應(yīng)產(chǎn)物4℃冰箱保存。

1.2.5 RFLP酶切體系及反應(yīng)條件 RFLP酶切體系：反應(yīng)體積為20 mL，PCR反應(yīng)產(chǎn)物10 mL，0.5 mLBsrBI內(nèi)切酶，2 mL 10×NEBuffer(內(nèi)切酶配套)，1 μl 2.5 mM的MgCl2，最后加超純水至20 μl。

RFLP反應(yīng)條件：將上述RFLP酶切反應(yīng)體系加好后，充分混勻后，短暫離心，然后將其放入37 ℃的恒溫箱內(nèi)反應(yīng)4 h即可。

M：D2000，1、3泳道為ii基因型；2、5、9、10泳道為II基因型；4、6、7、8、11、12泳道為Ii基因型圖2 拉薩白雞PMEL17 基因第10外顯子PCE-RFLP的凝膠圖

表2 拉薩白雞PMEL17基因突變位點(diǎn)的基因型及其基因型頻率分布

2 結(jié)果與分析

3種基因型的檢測結(jié)果為：花羽公雞II基因型有1羽，基因型頻率為0.0044，Ii基因型有0羽，基因型頻率為0.0000，ii基因型有7羽，基因型頻率為0.0307；花羽母雞II基因型有1羽，基因型頻率為0.0044，Ii基因型有44羽，基因型頻率為0.0219，ii基因型有17羽，基因型頻率為0.1316；白羽公雞II基因型有10羽，基因型頻率為0.0439，Ii基因型有44羽，基因型頻率為0.1930，ii基因型有17羽，基因型頻率為0.0745；白羽母雞II基因型有19羽，基因型頻率為0.0833，Ii基因型有78羽，基因型頻率為0.3421，ii基因型有16羽，基因型頻率為0.0702；總的II基因型有31羽，基因型頻率為0.1360，Ii基因型有127羽基因型頻率為0.5570，ii基因型有70羽，基因型頻率為0.3070(表2)。

本試驗(yàn)是通過對780羽母雞、161羽公雞翅靜脈采血，提取DNA，然后通過PCR-RFLP技術(shù)對其分析，最后將含有Ii基因型和ii基因型的母雞60羽和含有Ii基因型和ii基因型的9羽公雞組群，將其種蛋進(jìn)行孵化試驗(yàn)，在22周齡的時候，將其最后所得的228羽拉薩白雞進(jìn)行翅靜脈采血，通過PCR-RFLP技術(shù)對其分析，結(jié)果表明：Ii基因型的最多，有127羽，Ii基因型頻率為0.5570，其中花羽公雞不含有Ii基因型，花羽母雞含有5羽Ii基因型，其基因型頻率為0.0219，白羽公雞含有44羽Ii基因型，其基因型頻率為0.1930，白羽母雞含有Ii基因型78羽，其基因型頻率為0.3412；ii基因型的有70羽，位居第二，ii基因型頻率為0.3070，其中花羽公雞有7羽ii基因型，其基因型頻率為0.0307，花羽母雞含有30羽ii基因型，其基因型頻率為0.1316，白羽公雞含有17羽ii基因型，其基因型頻率為0.0745，白羽母雞含有ii基因型16羽，其基因型頻率為0.0702；II基因型的含量最少，有31羽，基因型頻率為0.1360，其中花羽公雞含有1羽II基因型，其基因型頻率為0.0044，花羽母雞含有1羽II基因型，其基因型頻率為0.0044，白羽公雞含有10羽II基因型，其基因型頻率為0.0439，白羽母雞含有19羽II基因型，其基因型頻率為0.0833。

本研究采用PCR-RFLP技術(shù)分析拉薩白雞的基因組DNA的PMEL17基因序列的第10外顯子上是否存在9 bp的插入，發(fā)現(xiàn)(圖1～2)PMEL17基因序列的第10外顯子存在9 bp插入突變時，擴(kuò)增目的片段長度為184和42 bp，為II基因型純合子的個體，且為顯性白羽純合個體；PMEL17基因序列的第10外顯子存在9 bp插入突變，且擴(kuò)增目的片段長度為217，184和42 bp，為Ii基因型的雜合的個體，且為顯性白羽雜合個體；PMEL17基因序列的第10外顯子不存在9 bp插入突變，且擴(kuò)增目的片段長度為217 bp，為ii基因型，且為非顯性白羽個體。

3 討 論

在本試驗(yàn)中，其顯性白羽雜合個體最多，為127羽，基本符合Ii基因型個體占總個體數(shù)(228羽)的1/2，非顯性白羽基因ii的個體為70羽，基本符合ii基因型個體占總個體數(shù)(228羽)的1/4。在此研究基礎(chǔ)上，根據(jù)實(shí)際需要，將其II基因型的個體單獨(dú)組群，就可以得到顯性白羽純合個體；也可以將Ii顯性雜合個體和ii非顯性白羽個體組群，從而挑選出我們所需要的基因型；也可以將ii基因型單獨(dú)組群，從而得到花色羽的個體。

動物毛色的形成過程與黑色素的產(chǎn)生和沉淀關(guān)系緊密，超過127個基因影響毛色的形成過程[10]，但大多數(shù)基因是控制黑色素合成或作用于黑色素合成的通路上。動物毛色和羽色一直是育種工作者關(guān)注的重要性狀，主要受到動物體內(nèi)黑色素產(chǎn)生和沉積的影響，是多個基因共同作用的結(jié)果。黑色素的產(chǎn)生和沉積主要發(fā)生在黑素小體的淀粉樣纖維結(jié)構(gòu)上[11-13]，PMEL17基因所編碼的前黑素小體蛋白是這一過程所不可或缺的。本研究與Kerje等[4]發(fā)現(xiàn)，PMEL17基因在第10外顯子上9 bp的插入是雞顯性白性狀的主要原因，揭示了雞顯性白性狀的分子作用、Berson等[5]報道的雞PMEL基因編碼一種黑色素細(xì)胞特異性蛋白，這種存在于前黑素體基質(zhì)重的蛋白對黑色素聚集以及黑素細(xì)胞正常發(fā)育起作用、Martinez等[14]報道的小鼠silv基因的突變導(dǎo)致體內(nèi)黑色素細(xì)胞的丟失，從而使得毛色變?yōu)殂y灰色、Menottiraymond等[15]報道的在家貓上，SILVER位點(diǎn)的突變同樣對黑色素的產(chǎn)物存在著一定的影響、李蓓等[16]報道的馬的銀灰色被毛與PMEL基因多態(tài)性緊密相關(guān)、劉小軍等[17]報道的壩上長尾雞PMEL17基因是影響羽色形成的重要基因，通過和其他基因互作對皮膚毛色形成以及其他組織色素形成均有作用、姚文成等[18]報道的PMEL17基因的多態(tài)性與鴨羽毛性狀具有一定的關(guān)聯(lián)性相一致。

4 結(jié) 論

通過本試驗(yàn)，為拉薩白雞今后育種工作的開展提供另一個思路，通過分子選擇PMEL17基因序列的第10外顯子的9 bp插入突變作為拉薩白雞羽毛顏色性狀的功能基因的分子選育提供了理論基礎(chǔ)。