郝志強(qiáng) 王勤章 錢成

摘要：目的? 構(gòu)建納米細(xì)菌Wistar雄性大鼠腎結(jié)石模型，動(dòng)態(tài)監(jiān)測血、尿生化各項(xiàng)指標(biāo)，旨在為進(jìn)一步研究納米細(xì)菌在腎結(jié)石發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用，提供數(shù)據(jù)支持，進(jìn)而為腎結(jié)石病因?qū)W的下一步探索提供新思路。方法? 將60只大鼠隨機(jī)分為納米細(xì)菌組和空白對(duì)照組，每組30只。納米細(xì)菌組給予尾靜脈注射1.2 ml NB懸液，空白對(duì)照組給予尾靜脈注射1.2 ml生理鹽水，實(shí)驗(yàn)周期為10周，每周每組各處死大鼠3只，處死前采集大鼠血、尿標(biāo)本，供生化分析，并取兩側(cè)鮮活腎臟標(biāo)本，用于病理結(jié)晶情況檢測及計(jì)算腎體比。結(jié)果? 自第8周開始，納米細(xì)菌組腎體比值大于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。截至第10周末，納米細(xì)菌組大鼠腎臟晶體陽性11只，空白對(duì)照組均為陰性，納米細(xì)菌組大鼠腎臟晶體陽性率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與空白對(duì)照組相比，納米細(xì)菌組第4～8周血肌酐、第3～8周血尿酸、第3～9周尿素氮及尿鈣水平均升高，第8周納米細(xì)菌組尿pH高于空白對(duì)照組差，第6～7周納米細(xì)菌組血鈣高于空白對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論? 腎體比、結(jié)晶陽性率、血肌酐、血尿酸、血尿素、尿鈣等重要指標(biāo)的有效升高，均顯示納米細(xì)菌Wistar雄性大鼠腎結(jié)石實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷某晒χ苽?，這為進(jìn)一步揭示NB在結(jié)石形成過程中所起的作用以及后續(xù)對(duì)腎結(jié)石病因?qū)W的進(jìn)一步研究提供了良好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：腎結(jié)石;納米細(xì)菌;血、尿生化;腎功;大鼠腎結(jié)石模型

中圖分類號(hào)：R692.4;R322? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.11.017

文章編號(hào)：1006-1959（2019）11-0058-06

Abstract：Objective? To construct a kidney model of nano-bacteria Wistar male rats， and to dynamically monitor blood and urine biochemical indicators， in order to further study the role of nanobacteria in the development of kidney stones， provide data support， and then the etiology of kidney stones. The next step is to explore new ideas. Methods? 60 rats were randomly divided into a nanobacteria group and a blank control group， with 30 rats in each group. The nanobacterial group was given a 1.2 ml suspension of NB in the tail vein， and the blank control group was given a 1.2 ml saline solution in the tail vein. The experimental period was 10 weeks. Three rats died in each group per week. Blood and urine were collected before sacrifice. Specimens for biochemical analysis， and take fresh kidney specimens on both sides for pathological crystallization and calculation of renal to body ratio. Results? Since the 8th week， the renal body ratio of the nanobacterial group was larger than that of the blank control group，the difference was statistically significant （P<0.05）. By the end of the 10th week， there were 11 kidney crystals in the nano-bacterial group， and the blank control group was negative. The positive rate of renal crystal in the nano-bacterial group was higher than that in the blank control group，the difference was statistically significant （P<0.05）.Compared with the blank control group， the serum creatinine of the nanobacterial group was 4 to 8 weeks.At the 3rd to 8th week， blood uric acid and urea nitrogen and urinary calcium increased at the 3rd to 9th week. At the 8th week， the urine pH of the nanobacterial group was lower than that of the blank control group. The blood calcium level of the nanobacterial group was higher than that of the 6th to 7th week. The blank control group had significant differences （P<0.05）. Conclusion? The effective increase of renal body ratio， crystallization rate， serum creatinine， blood uric acid， blood urea， urinary calcium and other important indicators have shown the successful preparation of the experimental model of kidney calculus in nano-bacteria Wistar male rats， which further reveals NB. The role played by the formation of stones and the subsequent further study of the etiology of kidney stones provide a good experimental basis and data support.

Key words：Kidney stones;Nanobacteria;Blood，urine biochemistry;Kidney function;Rat kidney stone model

腎結(jié)石（kidney stones）是泌尿系結(jié)石的主要組成部分，是泌尿外科臨床診療中的常見病與多發(fā)病，腎結(jié)石病因復(fù)雜，涉及環(huán)境、飲食、代謝以及遺傳易感性等諸多方面。納米細(xì)菌（nanobacteria，NB）是芬蘭科學(xué)家Ciftcioglu N等[1]在哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種具有細(xì)胞毒作用且具有生物被膜的生物，隨著對(duì)納米細(xì)菌各項(xiàng)生物學(xué)特性的不斷了解，人們發(fā)現(xiàn)NB在泌尿系結(jié)石的發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，NB所特有的生物礦化功能[2-6]在臨床許多鈣化性疾病中都得到了有效驗(yàn)證，NB作為鈣化的核心[7-11]，并進(jìn)一步促進(jìn)了鈣化的發(fā)展。本研究立足于納米細(xì)菌Wistar雄性大鼠腎結(jié)石模型的建立之上，對(duì)其血、尿生化進(jìn)行動(dòng)態(tài)記錄分析，旨在為腎結(jié)石病因?qū)W的進(jìn)一步研究，提供新的思路。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物? 選取6周齡左右，體重（200±20） g，Wistar雄性大鼠60只，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均是來源于新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)[合格證號(hào)SCXK（新）2013-0001;新醫(yī)動(dòng)字SYXK（新）2010-0003]雄性大鼠，福利倫理審查證號(hào)：[2016]院倫審動(dòng)實(shí)字（001）號(hào)（NO）A2016-001。將60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為納米細(xì)菌組（NB組）和空白對(duì)照組（NC組）各30只，兩組大鼠均先于新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，飼料購自石河子大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器與試劑? 儀器：電子天平（江蘇常熟市大量儀器有限責(zé)任公司，LT1000B）、全自動(dòng)生化分析儀（德國羅氏，Modual DPP）、多功能光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)（日本Olympus，BX40）、透射電鏡（日本JEOL，JEOL-1230 Electronics）。試劑：納米細(xì)菌懸濁液（自制）、0.9%生理鹽水、蘇木素染液（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科贈(zèng)）、伊紅染液（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科贈(zèng)）、10%中性福爾馬林（石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理科贈(zèng)）。

1.3模型建立及標(biāo)本采集? 納米細(xì)菌組給予尾靜脈注射1.2 ml NB懸液，空白對(duì)照組給予尾靜脈注射1.2 ml 0.9%生理鹽水，實(shí)驗(yàn)周期為10周，每周每組各處死大鼠3只。記錄各組連續(xù)10周內(nèi)飲食飲水、行為活動(dòng)等情況，并實(shí)時(shí)測量記錄其體重變化。

1.4觀察指標(biāo)

1.4.1 病理切片? 處死前采集大鼠血、尿標(biāo)本，供生化分析，并取兩側(cè)鮮活腎臟標(biāo)本，供病理結(jié)晶情況檢測、計(jì)算腎體比。腎體比=（腎臟重量/體重×100%）。肉眼觀察腎臟的顏色及其大小改變。將標(biāo)本制成石蠟病理切片，常規(guī)HE染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)晶的形成情況，按文獻(xiàn)提供的腎臟結(jié)晶分級(jí)（0～Ⅳ級(jí)）判定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[12]。

1.4.2生化指標(biāo)? 使用全自動(dòng)生化分析儀檢測肌酐，尿素，尿酸，尿鈣，血鈣，血鎂，血磷等生化指標(biāo)，進(jìn)行分析。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法? 實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用（x±s）表示，組間分析采用方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用SNK-q檢驗(yàn)，顯著性水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05顯示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1大鼠一般情況觀察? 第1～2周，兩組大鼠表現(xiàn)無異，飲食飲水均正常，安靜溫順;第3～8周時(shí)，空白對(duì)照組大鼠進(jìn)食良好、性情溫順，與前無異，納米細(xì)菌組大鼠逐漸變得煩躁不安、活動(dòng)度明顯升高;至第9～10周，空白對(duì)照組仍然無明顯改變，納米細(xì)菌組表現(xiàn)為食欲減低，活動(dòng)減少，精神倦怠。

2.2大鼠腎臟標(biāo)本肉眼觀? 動(dòng)態(tài)觀察10周大鼠腎臟標(biāo)本，肉眼可見空白對(duì)照組大鼠腎臟表面光滑，剖面呈現(xiàn)暗紅色，皮髓結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯斑點(diǎn)顆粒;納米細(xì)菌組從第4周開始，部分腎臟較空白對(duì)照組略有增大，剖面呈紅褐色，髓質(zhì)呈淺紅色，皮髓結(jié)構(gòu)清晰，腎盞及腎孟良好;第6周以后納米細(xì)菌組部分腎臟皮髓結(jié)構(gòu)尚清晰，但有少量散在淡黃色顆粒沉積在腎組織中，觸之有沙礫感。肉眼觀，空白對(duì)照組無異常，納米細(xì)菌組可見黃色顆粒自腎盂向周圍，呈點(diǎn)狀分布。自第8周開始，納米細(xì)菌組腎體比值大于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表1。

2.3大鼠腎臟標(biāo)本解剖顯微鏡觀察? 解剖顯微鏡下可見，空白對(duì)照組大鼠腎臟內(nèi)無晶體沉積，未見明顯病理改變。納米細(xì)菌組大鼠自第4周起，其腎臟病理切片可見灰白色晶體（見圖1）。10周計(jì)數(shù)，納米細(xì)菌組大鼠腎臟晶體陽性11只（陽性率52.38%），空白對(duì)照組均為陰性，見表2;截至第10周末，納米細(xì)菌組大鼠腎臟晶體陽性率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。因?yàn)榧{米細(xì)菌組大鼠在第4周開始成石，而前4周已處死的大鼠也存在成石的可能，所以在計(jì)算成石率時(shí)將前幾周已處死的大鼠排除在大鼠總計(jì)數(shù)之外。

2.4兩組血液生化比較? 第1～8周，納米細(xì)菌組大鼠肌酐、尿酸、尿素均有不同程度的升高，第9～10周略有下降（見圖2）。納米細(xì)菌組與空白對(duì)照組比較，第6～7周血鈣、第4～8周肌酐、第3～8周尿酸、第3～9周尿素，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表3;其余各周水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。納米細(xì)菌組血磷與血鎂與空白對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.5兩組大鼠尿液生化比較? 兩組均可見第1～8周尿鈣水平有所提高，第9～10周，尿鈣稍下降（見圖3）。經(jīng)檢驗(yàn)，納米細(xì)菌組與空白對(duì)照組比較，第3～9周尿鈣與第8周尿pH值比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見表4，其余各周比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。24h尿量與尿比重分別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

3討論

生化檢測可反映機(jī)體諸多情況，血肌酐、血尿酸、血尿素等是檢查腎臟功能的重要指標(biāo)，其測量值的改變直接反應(yīng)機(jī)體腎臟功能的變化，本研究通過建立納米細(xì)菌Wistar雄性大鼠腎結(jié)石模型，對(duì)造模組與空白對(duì)照組分別進(jìn)行干預(yù)，采集其血、尿標(biāo)本進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測分析，旨在為腎結(jié)石病因?qū)W的研究提供實(shí)驗(yàn)支持。

本研究顯示，自第8周開始，納米細(xì)菌組腎體比值高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;10周計(jì)數(shù)，納米細(xì)菌組大鼠腎臟晶體陽性11只（陽性率52.38%），空白對(duì)照組均為陰性，納米細(xì)菌組大鼠腎臟晶體陽性率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;納米細(xì)菌對(duì)大鼠腎臟形成損傷，最終導(dǎo)致腎結(jié)石的發(fā)生，繼而影響大鼠的性情及行為活動(dòng)。

腎小管細(xì)胞損傷學(xué)說是腎結(jié)石發(fā)病機(jī)制的主要學(xué)說之一，腎小管細(xì)胞的損傷增加了結(jié)晶粘附和停滯的機(jī)率，促進(jìn)了結(jié)石的形成[14，15]。國內(nèi)外眾多學(xué)者通過[10]辛文虎，明星.腎小管上皮細(xì)胞損傷與草酸鈣腎結(jié)石形成機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國際泌尿系統(tǒng)雜志，2013，33（4）：539-542..

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收稿日期：2018-12-2;修回日期：2019-2-25

編輯/肖婷婷