王 健

(中國人民解放軍94750部隊醫(yī)院門診所，福建 龍巖 366200)

疼痛(Pain)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙與代謝紊亂的一類疾病，是臨床上常見的癥狀之一。由于其發(fā)生機制復雜，目前尚缺乏有效的治療手段。神經(jīng)元是構成神經(jīng)系統(tǒng)結構和功能的基本單位，在疼痛的發(fā)生與發(fā)展過程中扮演著主要角色。既往研究表明當外周神經(jīng)受到損傷時，受損局部的神經(jīng)末梢以及脊髓背角內(nèi)活化的膠質(zhì)細胞會釋放如趨化因子CXCL1，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、興奮性氨基酸、以及一氧化氮(NO)等物質(zhì)，與神經(jīng)元上的相應受體結合，從而使得神經(jīng)元發(fā)生活化[1-2]。

環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(cAMP-response element binding protein；CREB)是一種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，在神經(jīng)元上廣泛存在，并且CREB能夠作用于特定的基因進而影響該基因的表達。有研究表明，當外周神經(jīng)受到損傷時，脊髓背角淺層神經(jīng)元內(nèi)CREB的磷酸化水平處于高表達狀態(tài)，并且給予PKA的激動劑可以顯著增加CREB的磷酸化水平[3]，促進疼痛的發(fā)生，這也間接證明了CREB在疼痛中發(fā)揮的重要作用。

雷公藤內(nèi)酯醇(T10)是中藥雷公藤的主要有效成分，具有抗炎、免疫抑制的重要作用。有研究報道稱，鞘內(nèi)給予T10能夠明顯緩解由脊神經(jīng)結扎(SNL)引起的神經(jīng)病理性痛，并且抑制由SNL誘導的膠質(zhì)細胞的激活以及細胞因子的釋放[4-5]。但其具體的鎮(zhèn)痛機制尚不十分清楚。N-甲基-D-門冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid，NMDA)受體在疼痛的發(fā)生與發(fā)展過程中扮演著重要的角色，其選擇性的拮抗劑，能夠長時程的阻斷NMDA受體并且明顯抑制神經(jīng)病理性痛狀態(tài)下神經(jīng)元的超興奮性，臨床上常用于復雜性局部痛綜合征和截肢后幻肢痛的治療。NR2B亞單位在脊髓的表達局限于和疼痛密切相關的背角淺層，因此針對NR2B亞單位的拮抗劑效果較為明顯、且其副作用通常都較小。綜合以上結果，不難看出NR2B亞單位和CREB的磷酸化參與了疼痛發(fā)生與發(fā)展過程中神經(jīng)元內(nèi)的相關分子機制的改變。因此，本研究擬通過神經(jīng)病理性痛模型大鼠進一步探究鞘內(nèi)聯(lián)合給予T10和MK-801對脊髓背角淺層神經(jīng)元內(nèi)NR2B以及CREB磷酸化水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性SD大鼠，體重220～250 g(由第四軍醫(yī)大學動物實驗中心提供)。恒溫22～25℃飼養(yǎng)并保證12 h的光照，動物可自由攝取水和食物。采用隨機數(shù)字表法，隨機分為6組(n=36)：正常對照組(normal)，假手術—生理鹽水組(sham-saline)，脊神經(jīng)結扎—生理鹽水組(SNL-saline)，SNL-T10組，SNL-MK-108組，SNL-T10+MK-108組。所有實驗均在第四軍醫(yī)大學倫理委員會批準下進行。

1.2 實驗試劑與設備

實驗過程中使用的試劑主要包括T10(福建醫(yī)學科學院)、MK-801(Sigma)、兔抗p-CREB IgG(Cell Signal Technology)、兔抗p-NR2B IgG(Santa Cruz)、小鼠抗NeuN IgG (Millipore)、生物素 (biotin) 結合的驢抗兔 IgG(Jackson Immuno-Research)、生物素結合的驢抗小鼠IgG(Millipore)，Alexa594結合的卵白素(Avidin，Invitrogen)、Alexa488結合的驢抗小鼠IgG(Jackson Immuno-Research)、小鼠抗β-actin IgG(Sigma)、HRP結合的驢抗兔和小鼠IgG(北京中杉)、Von-Frey 細絲(Stoelting)、恒冷箱冰凍切片機(Leica，CM1800)、10%十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(Bio-Rad)、聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)、多通道激光共聚焦顯微鏡(FV1000，Olympus)。

1.3 鞘內(nèi)置管

7%水合氯醛腹膜腔注射麻醉大鼠(0.4 mL/100 g)，待麻醉徹底后備皮并在脊椎L4～S1節(jié)段沿后正中線作長約5 cm的縱切口，分層切開皮膚、皮下組織和肌肉，鈍性分離肌肉直至椎骨暴露于視野中。剪刀剪開并用咬骨鉗咬掉腰椎棘突，鈍性分離棘突兩側肌肉和筋膜至清晰暴露硬脊膜，用注射器輕輕破開硬脊膜。順應硬脊膜破口處經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔向頭側緩慢地插入預先用無菌生理鹽水灌充的PE-10導管，直至導管吻側到達腰膨大(L4～L5)部位。用微量注射器經(jīng)導管外口注入約10 mL無菌生理鹽水，若硬脊膜破口處有腦脊液或氣泡溢出即封住導管外口。將封口后的管口通過皮下穿出至頸部固定并分層縫合，創(chuàng)傷局部抗炎抗感染。鞘內(nèi)置管3 d后挑選整體狀態(tài)良好、無運動功能障礙的大鼠進行下一步實驗，置管成功與否可行鞘內(nèi)注射0.2%利多卡因10 μL，觀察大鼠下肢及尾部是否出現(xiàn)癱瘓或運動功能障礙。

1.4 SNL和鞘內(nèi)給藥

7%水合氯醛腹膜腔注射麻醉大鼠(0.4 mL/100 g)，待麻醉徹底后備皮并在脊椎L4～S1節(jié)段沿后正中線作長約5 cm的縱切口，分層切開皮膚、皮下組織和肌肉，鈍性分離肌肉直至椎骨暴露于視野中。鈍性分離左側椎旁肌肉，切除L6脊椎橫突，將L4～L6脊神經(jīng)用玻璃挑針分離，3.0細鉻絲線緊緊結扎L5脊神經(jīng)，分層縫合后局部抗炎抗感染。Sham組給與同期處理但不結扎神經(jīng)。根據(jù)課題組之前對T10和MK-801藥效結果的研究[6]，取T10劑量的ED50值(10 μg/kg，鞘內(nèi)注射)與MK-801劑量的ED50值(30 μg/kg，鞘內(nèi)注射)于術后第3～7天的實驗組每天單獨給予10 μLT10或MK-801以及T10與MK-801各5 μL進行聯(lián)合給藥。

1.5 機械性痛閾測定

鞘內(nèi)注射藥物后2 h，將各組大鼠置于高架網(wǎng)格有機玻璃罩內(nèi)適應約30 min。用Von-Frey纖維細絲(1.4～26 g)緩慢給與大鼠術側后足足心施壓彎成“S”形，檢測過程中以持續(xù)時間≤5 s為標準，若大鼠出現(xiàn)縮足、舔足或撤足等行為則視為對該強度細絲敏感(此時記下該細絲承受的強度)，否則視為不敏感并繼續(xù)后續(xù)強度測定。測定伊始從1.4g開始逐漸增大強度，同一強度的纖維絲測試10次，每次間隔2 min，10次中若有6次及以上出現(xiàn)敏感反應(>60%)的最低強度視為此刻機械縮足閾值。各組大鼠均在造模前連續(xù)2 d及造模后1～10 d給與縮足閾值測定。

1.6 免疫熒光化學染色

將各組大鼠于給藥后的第4天，使用7%水合氯醛腹膜腔注射麻醉(0.4 mL/100 g)，待麻醉徹底后迅速開胸，建立體外灌注通道后用約200～250 mL磷酸緩沖液(PB，0.01 mol/L，pH 7.2～7.4)沖去大鼠體內(nèi)血液，待大鼠肝臟出現(xiàn)白褐跡象時用含4%多聚甲醛的的PB(0.1 mol/L，pH7.2～7.4)500 mL先快后慢固定約1～1.5 h。灌注完畢取出脊髓腰膨大節(jié)段于上述固定液中后固定2 h左右，后置于含30%蔗糖的PB(0.1 mol/L，pH7.2～7.4)溶液中4℃環(huán)境下脫水2 d，取出腰膨大節(jié)段并用恒冷箱切片機將其橫切，切片厚約25 μm，將切片置于PBS(0.1 mol/L，pH7.2～7.4)中漂洗5 min 3次后，滴加5%山羊血清37℃封閉2 h，后加入小鼠抗Neu NIgG(1∶200)和兔抗p-CREBIgG(1∶100)于室溫下?lián)u床孵育1 h后，置于4℃孵育48 h；生物素結合的驢抗兔IgG(1∶500)，室溫下孵育6 h；Alexa 488標記的驢抗小鼠IgG(1∶500)和Alexa594標記的Avidin(1∶500)4 h。一抗和二抗的孵育液為含5%驢血清、0.3% TritonX-100、0.05%疊氮鈉和0.25%角叉菜膠的0.01 mol/LPBS溶液，三抗的孵育液為含0.3% Triton X-100的0.01 mol/LPBS溶液。反應結束后在暗光條件下漂洗、裱片，待自然晾干后熒光封片劑封片，多通道激光共聚焦顯微鏡下觀察并攝片，所有切片均在同一背景下拍攝。

1.7 Western blot

將各組大鼠于給藥后的第4天，使用7%水合氯醛腹膜腔注射麻醉(0.4 ml/100 g)，待麻醉徹底后迅速開胸，建立體外灌注通道并用事先預冷的PBS溶液(0.01 mol/L，pH7.2～7.4)快速沖血，取出腰膨大節(jié)段并于冰上迅速分離右側腰膨大處脊髓背角，將取好的組織加入事先溶解有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的強效組織裂解液中，勻漿機低溫勻速裂解后，置于離心機中4℃離心5 min(12000 r/min)，取出離心管并吸取上清液，使用BCA法進行組織蛋白定量。蛋白樣品采用10%的SDS-PAGE進行電泳分離，每個樣孔確定含10 μg及以上的蛋白上樣體積，參照孔加入預染蛋白marker，根據(jù)其位置確定所需蛋白pNR2B、pCREB及β-actin的位置，切取所需凝膠并電轉(zhuǎn)到預先用甲醇溶液浸泡1min激活的PVDF膜上行免疫雜交反應。5%脫脂奶粉封閉2 h后加入對應的一抗[兔抗p-NR2BIgG(1∶100)，兔抗p-CREBIgG(1∶200)，小鼠抗β-actinIgG(1∶5000)]，4℃環(huán)境下孵育過夜后TBS-T漂洗10 min 3次，分別加入HRP結合的驢抗兔和小鼠IgG(1∶5000)室溫孵育1 h；TBS-T漂洗5 min 3次后，在Bio-Rad成像系統(tǒng)中向條帶中滴加化學發(fā)光液激發(fā)熒光并進行熒光條帶的掃描，ImageLab攝片并分析條帶的熒光密度值，以pNR2B、pCREB與β-actin的熒光密度值之比計算出各組相對蛋白表達量。

1.8 統(tǒng)計學方法

本研究所有數(shù)據(jù)均在SPSS 19.0軟件中進行統(tǒng)計分析，采用Mean±SEM表示，單因素方差分析進行組間差異的比較，兩獨立樣本的t檢驗比較對照組與實驗組的行為學痛閾及pCREB與蛋白的表達差異，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 鞘內(nèi)聯(lián)合給予T10和MK-801對SNL誘導的機械性痛敏的影響

SNL術前2天和術后1～10 d連續(xù)檢測大鼠PWT(見圖1)，結果顯示：術后第1 d起，SNL組大鼠術側后爪機械性縮足閾值(PWT)明顯下降(P<0.01)，且在3 d之后基本保持平穩(wěn)；SNL-T10組或SNL-MK-801組大鼠在鞘內(nèi)分別給予T10或MK-801干預后第3 d術側后爪的PWT明顯提高，與給藥前相比有顯著性差異(P<0.05)；SNL-T10+MK-801聯(lián)合給藥組大鼠第3 d術側后爪的PWT提高幅度較SNL-T10組或SNL-MK-801組明顯，與SNL-saline組相比較差異更加顯著(P<0.01)；停止給藥后，SNL-T10+MK-801聯(lián)合給藥組較SNL-T10組或SNL-MK-801組單獨給藥組鎮(zhèn)痛療效持續(xù)時間長。

圖1 鞘內(nèi)給予T10、MK-801及二者聯(lián)合使用 對大鼠SNL誘導的痛閾的影響

2.2 鞘內(nèi)聯(lián)合給予T10和MK-801對脊髓背角磷酸化的NR2B亞單位表達的影響

Western blot結果顯示(見圖2)：與正常組或假手術組相比較，SNL-saline組大鼠在術后第7天術側背角磷酸化的NR2B亞單位的表達明顯上調(diào)(P<0.01);SNL-T10組或SNL-MK-801組在鞘內(nèi)單獨給予T10或MK-801后術側脊髓背角NR2B的磷酸化水平明顯下調(diào)(P<0.05)；而SNL-T10+MK-801組在鞘內(nèi)聯(lián)合給予T10和MK-801后第7天，大鼠術側背角NR2B的磷酸化水平較SNL-T10組或SNL-MK-801組明顯下調(diào)(P<0.05)。

2.3 鞘內(nèi)聯(lián)合給予T10和MK-801對脊髓背角磷酸化的CREB表達的影響

免疫熒光組織化學雙標染色結果顯示：磷酸化的CREB大量表達于腰膨大節(jié)段脊髓背角神經(jīng)元的胞體內(nèi)(見圖3A，D)，與NeuN陽性神經(jīng)元呈雙重標記。Western blot檢測結果顯示(見圖4)，與Sham-saline組相比，SNL-saline組磷酸化的CREB的表達水平明顯上調(diào)(P<0.01)，鞘內(nèi)聯(lián)合給予T10和MK-801能夠明顯下調(diào)CREB的磷酸化水平(P<0.01)。

圖2 鞘內(nèi)給予T10、MK-801及二者聯(lián)合使用對大鼠脊髓背角pNR2B蛋白表達的影響

圖3 磷酸化CREB表達于脊髓背角淺層神經(jīng)元中

圖4 鞘內(nèi)給予T10、MK-801及二者聯(lián)合對大鼠脊髓背角pCREB蛋白表達的影響

3 討論

本實驗通過L5脊神經(jīng)結扎構建慢性神經(jīng)病理性痛模型，觀察到SNL可以明顯誘導大鼠術側后足機械性痛敏。之后通過免疫熒光雙標染色方法觀察到脊髓背角pCREB主要表達在神經(jīng)元的胞體內(nèi)；采用Western blot方法檢測到SNL后大鼠脊髓背角NR2B和CREB的磷酸化水平明顯增加。本實驗結果提示鞘內(nèi)聯(lián)合給予T10和MK-801能夠顯著緩解大鼠術側后爪的機械性痛閾，效果較單獨給予T10或MK-801時明顯，同時降低了NR2B和CREB的磷酸化水平。

當外周神經(jīng)受到損傷時，脊髓背角的小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞會被序貫激活[7]，激活的膠質(zhì)細胞會釋放大量的促炎癥細胞因子如IL-6，IL-1β，TNF-α等炎癥介質(zhì)，這些介質(zhì)可與神經(jīng)元上的相應受體結合，從而使得神經(jīng)元發(fā)生活化，參與慢性痛的發(fā)生與發(fā)展。既往研究報道，NO可以與神經(jīng)元上NMDA受體特定的區(qū)域結合，從而提高了神經(jīng)元的興奮毒性[8-9]。因此，抑制NMDA受體能夠有效降低神經(jīng)元的興奮性。

環(huán)磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)又被稱為轉(zhuǎn)錄增強因子，是一種基因調(diào)節(jié)蛋白。在促炎癥細胞因子、興奮性氨基酸以及一氧化氮(NO)等刺激下，神經(jīng)元中活化的PKA進入細胞核，通過氨基端激酶誘導域磷酸化來活化CREB，從而調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄。本研究結果提示，SNL模型大鼠鞘內(nèi)聯(lián)合給予T10和MK-801后，其術側后爪熱機械性痛閾明顯提高(P<0.05)，CREB的磷酸化水平也顯著降低，神經(jīng)元的興奮性也得到一定的抑制，從而阻礙了神經(jīng)病理性痛的發(fā)生與發(fā)展。

T10作為中藥雷公藤中的藥效成分，其藥理活性強，性質(zhì)穩(wěn)定，具有抗過敏，免疫抑制、抗腫瘤、抗感染等作用[10-11]；目前在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等各種自身免疫性疾病和器官移植引起的免疫排斥反應以及免疫系統(tǒng)介導的炎癥反應中具有廣泛應用。MK-801是谷氨酸受體的特異性拮抗劑，在臨床癲癇等疾病的治療中效果顯著。本實驗中，我們利用T10的抗炎和MK-801的抗谷氨酸毒性的作用，將二者聯(lián)合應用于慢性神經(jīng)病理性痛SNL模型中。結果提示，T10+MK-801聯(lián)合給藥的鎮(zhèn)痛效果要明顯優(yōu)于T10或MK-801單獨給藥組，且減少了二者的使用劑量，一定程度上降低了T10與MK-801給機體帶來的毒副作用。其聯(lián)合作用機制可能與T10聯(lián)合MK-801抑制脊髓背角內(nèi)的炎癥反應以及NR2B和CREB的磷酸化進而影響神經(jīng)元的活性有關。但T10聯(lián)合MK-801是否還可能通過其他途徑影響神經(jīng)元的活性有待進一步深入研究。