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紅景天苷抑制補(bǔ)體成分對(duì)腦缺血/再灌注大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用

2019-07-04 03:00楊澤霖張小琴謝秀利汪旭雯唐宇恒劉俊杰賴文芳洪桂祝
中國藥理學(xué)通報(bào) 2019年7期
關(guān)鍵詞:紅景天補(bǔ)體貨號(hào)

黃 鑫,林 昱,楊澤霖,張小琴,謝秀利,汪旭雯,唐宇恒,劉俊杰,賴文芳,洪桂祝

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,福建 福州 350122)

腦卒中,中醫(yī)又稱為腦中風(fēng),是腦血管疾病中最為嚴(yán)重的并發(fā)癥,是由腦部血管突然破裂或因血管阻塞導(dǎo)致血液不能流入大腦而引起的腦組織損傷,包括缺血性和出血性卒中。目前,獲得美國FDA臨床應(yīng)用批件的藥物只有組織型纖維蛋白溶活劑,但是其存在治療“時(shí)間窗”窄(發(fā)病4.5 h之內(nèi)治療有效)和僅對(duì)3%~5%的腦卒中病人有治療效果的缺點(diǎn)[1]。因此,近年來對(duì)腦卒中的藥物研究已成為熱點(diǎn)。

中藥紅景天是景天科紅景天屬植物高山紅景天(RhodioldroseaL.)的干燥根莖,具有益氣活血、治療胸痹心痛、中風(fēng)偏癱等功效。紅景天苷(salidroside,Sal)是藥物紅景天的主要有效提取物,本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn),紅景天苷對(duì)大腦中動(dòng)脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[2-5]。補(bǔ)體系統(tǒng)是固有免疫的重要組成部分,通過經(jīng)典途徑、旁路途徑及甘露糖結(jié)合凝集素(mannose binding lectin,MBL)途徑激活,而補(bǔ)體C3處于兩條激活途徑的匯合點(diǎn),并為替代途徑激活的關(guān)鍵分子,在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活中發(fā)揮重要作用。補(bǔ)體系統(tǒng)在腦缺血/再灌注后過度激活,導(dǎo)致白細(xì)胞大量聚集和激活,造成組織和血管嚴(yán)重?fù)p傷[6]。研究認(rèn)為,補(bǔ)體系統(tǒng)過度激活的炎癥效應(yīng)片段是腦內(nèi)炎癥反應(yīng)損傷的主要始動(dòng)因素之一[7]。本文主要研究紅景天苷抑制補(bǔ)體成分,對(duì)MCAO大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用,探討紅景天苷的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康♀ SD大鼠45只,體質(zhì)量(260~280) g,購于上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司,合格證號(hào):2015000510392,許可證號(hào):SCXK(滬)2012-0002。于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng),許可證號(hào):SYXK(閩)2014-0005。

1.2 藥物與試劑紅景天苷(福建中醫(yī)藥大學(xué),純度≥98%,批號(hào):20151201);Bax抗體(貨號(hào):#2772)、Bcl-xl抗體(貨號(hào):#2762)、COX IV(貨號(hào):#4850),均購自Cell Signaling Technology公司;β-actin抗體(貨號(hào):H015)、組織線粒體分離試劑盒(產(chǎn)品編號(hào):C3606),均購自碧云天生物技術(shù)有限公司;FITC標(biāo)記羊抗鼠IgG(貨號(hào):ab7064)、TRITC標(biāo)記羊抗兔IgG(貨號(hào):ab6718)、神經(jīng)元特異性核蛋白(neuron specific nuclear protein,NeuN)抗體(貨號(hào):ab104224),均購自美國Abcam公司;SYBR Select Master Mix(美國Applied Biosystem公司,批號(hào):4472908);C3抗體(生工生物工程上海有限公司,貨號(hào):AB51005);RNeasy?Mini Kit(Qiagen公司,貨號(hào):74134);cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Thermo公司,貨號(hào):K1622)。

1.3 儀器倒置熒光顯微鏡(德國Leica公司);7900H-PCR儀(美國Applied Biosystems公司);小型垂直電泳槽、小型轉(zhuǎn)印槽、基礎(chǔ)電泳儀電源、ChemiDoc XRS+凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司);石蠟切片機(jī)、生物組織石蠟包埋機(jī)(湖北孝感亞光醫(yī)用電子有限公司);ND2000C紫外可見分光光度計(jì)(美國Thermo公司);激光共聚焦顯微鏡(德國Zeiss公司);3600AAA尼龍線栓(廣州佳靈生物技術(shù)有限公司);Nikon DS-Ril生物數(shù)碼顯微鏡(尼康儀器有限公司)。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham)、模型組(MCAO)、紅景天苷給藥組(MCAO+Sal),每組15只大鼠。造模2 h后,給藥組腹腔注射藥物(50 mg·kg-1·d-1),其余組注射0.9%生理鹽水(10 mL·kg-1·d-1),連續(xù)給藥6 d。

2.2 MCAO模型制備大鼠用2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)腹腔注射麻醉后,分離左側(cè)頸總動(dòng)脈(common carotid artery,CCA)、頸外動(dòng)脈(external carotid artery,ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(internal carotid artery,ICA),結(jié)扎CCA、ECA。動(dòng)脈夾夾閉ICA,用眼科剪在CCA血管壁上剪一小口,插入線栓至大腦中動(dòng)脈起始端。2 h后,將線栓抽出并結(jié)扎開口,實(shí)現(xiàn)再灌注,假手術(shù)組不進(jìn)行插線栓操作[8]。參考Zea-Longa的5級(jí)4分法[9]進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分,評(píng)分≥2分的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為模型制備成功,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 大鼠基因芯片檢測大鼠基因芯片由上??党缮锛夹g(shù)有限公司檢測。

2.4 qPCR檢測C1qa、C1qb、C1qc、C2、C3、C3a、C4a、C5ar、Cfh、Cfd mRNA表達(dá)取大腦組織,根據(jù)RNeasy?Mini Kit試劑盒說明,提取總RNA;根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,采用二步法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,用qPCR檢測C1qa、C1qb、C1qc、C2、C3、C3a、C4a、C5ar、Cfh、Cfd mRNA表達(dá)水平,PCR引物由生工生物工程上海有限公司合成,以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算2-ΔΔCt值。引物序列見Tab 1。

2.5 線粒體蛋白的制備取新鮮動(dòng)物組織,用剪刀把組織剪切成細(xì)小碎片。加入800 μL臨用前添加了PMSF的線粒體分離試劑A,進(jìn)行勻漿,以上操作均在冰上進(jìn)行。勻漿后,4 ℃離心5 min。將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中,再4 ℃離心10 min。小心去除上清,沉淀即為分離得到的線粒體。加入200 μL臨用前添加了PMSF的線粒體裂解液裂解線粒體,即得線粒體蛋白。

Tab 1 Primers used for quantitative real time PCR

2.6 Western blot檢測Bax、Bcl-xl、C3蛋白的表達(dá)提取總蛋白,采用SDS-PAGE凝膠電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜,用5% BSA封閉2 h后孵育一抗,加入一抗C3(1 ∶600)、β-actin(1 ∶3 000),4 ℃孵育過夜。搖床室溫孵育二抗2 h。PVDF膜用TBST洗滌10 min×3次后,加ECL顯色劑,采用凝膠成像系統(tǒng)檢測,以COX Ⅳ或β-actin為內(nèi)參,分析目的條帶/對(duì)應(yīng)內(nèi)參的相對(duì)表達(dá)量。

2.7 免疫組織熒光(IF)染色測定腦組織中C3、NeuN的表達(dá)大鼠連續(xù)給藥6 d后,2%戊巴比妥鈉(2 mL·kg-1)麻醉,打開胸腔,暴露心臟,于心尖處插入滯留針至主動(dòng)脈,剪開右心耳,立即灌注生理鹽水,通過體循環(huán)流出右心耳,直至流出液體無顏色,再灌注4%多聚甲醛至大鼠四肢僵硬,然后迅速取腦組織置4%多聚甲醛中固定24 h。使用腦膜具將全腦冠狀均等分成6片,進(jìn)行脫水、石蠟包埋及切片。腦組織切片進(jìn)行熒光染色后,使用激光共聚焦顯微鏡觀察。

3 結(jié)果

3.1 紅景天苷對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織基因表達(dá)圖譜的影響采用基因芯片方法分析腦組織基因表達(dá)圖譜發(fā)現(xiàn),缺血/再灌注的MCAO模型大鼠,經(jīng)紅景天苷連續(xù)作用6 d后,能夠抑制與補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)的基因表達(dá),基因芯片結(jié)果已存放在開放數(shù)據(jù)庫NCBI GEO:GSE52001,見Fig 1。

3.2 紅景天苷對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)基因的影響MCAO模型大鼠再灌注2 h后,連續(xù)給藥6 d,與Sham組比較,MCAO模型大鼠缺血側(cè)C1qa、C1qb、C1qc、C2、C3、C3a、C4a、C5ar、Cfh、Cfd mRNA表達(dá)增加;經(jīng)紅景天苷作用后,能夠抑制C1qa、C1qb、C1qc、C2、C3、C3a、C4a、C5ar、Cfh、Cfd mRNA的表達(dá),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見Fig 2。

3.3 紅景天苷對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)線粒體中Bax、Bcl-xl蛋白表達(dá)的影響MCAO模型大鼠再灌注1 h后,連續(xù)給藥6 d,如Fig 3所示,與Sham組比較,MCAO模型大鼠缺血側(cè)線粒體中Bax的蛋白表達(dá)升高,Bcl-xl蛋白表達(dá)降低;經(jīng)紅景天苷連續(xù)作用6 d后,明顯降低線粒體中Bax的蛋白表達(dá),升高Bcl-xl的蛋白表達(dá),且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

Fig 1 Cluster analysis of salidroside treatment and neuroprotective gene expression differences in MCAO rats

Each sample is the difference in gene expression between ischemic brain gene expression levels minus sham-operated mean values. The depth of color (red and green represent increase and decrease) indicates the difference in gene expression levels compared with sham.

3.4 紅景天苷對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織補(bǔ)體成分C3蛋白表達(dá)的影響補(bǔ)體成分C3是補(bǔ)體系統(tǒng)3條激活途徑中的核心成分,具有重要作用。Fig 4的Western blot結(jié)果顯示,與Sham組比較,MCAO模型大鼠缺血側(cè)補(bǔ)體成分C3蛋白表達(dá)增加,經(jīng)紅景天苷作用后,能夠抑制補(bǔ)體成分C3蛋白表達(dá)(P<0.05)。

3.5 紅景天苷對(duì)MCAO大鼠缺血側(cè)腦組織C3、NeuN表達(dá)的影響Fig 5的免疫組織熒光染色結(jié)果表明,與Sham組比較,MCAO組大鼠C3的熒光信號(hào)強(qiáng)度增加,NeuN的熒光信號(hào)強(qiáng)度降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);經(jīng)紅景天苷作用后,C3的熒光信號(hào)強(qiáng)度降低,同時(shí)NeuN的熒光信號(hào)強(qiáng)度增強(qiáng)(P<0.05)。

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用線栓法制備MCAO大鼠,該方法簡單可控、不需要開顱,對(duì)動(dòng)物損傷小、可以控制缺血與再灌注時(shí)間[10],并且可以較準(zhǔn)確地模擬臨床上腦缺血病況,是研究缺血性腦卒中的經(jīng)典動(dòng)物模型[11]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),紅景天苷能夠降低腦梗死體積,改善神經(jīng)功能損傷[2-5]。為進(jìn)一步研究紅景天苷的作用機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)以紅景天苷(50 mg·kg-1·d-1)作為研究劑量,經(jīng)Western blot檢測發(fā)現(xiàn),紅景天苷能夠明顯降低由MCAO引起的促凋亡蛋白Bax的表達(dá),明顯促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-xl的表達(dá),表明紅景天苷抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡與Bax/Bcl-xl有關(guān)。

Fig 2 Effects of salidroside treatment on C1qa, C1qb, C1qc, C2, C3 mRNA(A) and C3a, C4a,C5ar, Cfh, Cfd mRNA(B) in MCAO

##P<0.01vssham;*P<0.05,**P<0.01vsMCAO

Fig 3 Effects of salidroside treatment on Bax and Bcl-xl protein in MCAO

##P<0.01vssham;**P<0.01vsMCAO

Fig 4 Effects of salidroside treatment on C3

##P<0.01vssham;**P<0.01vsMCAO

課題組采用基因芯片方法分析腦組織基因表達(dá)圖譜,分析發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠抑制與炎癥反應(yīng)、補(bǔ)體系統(tǒng)相關(guān)的基因表達(dá),進(jìn)一步采用qPCR檢測C1q、C2、C4a等基因表達(dá),確認(rèn)紅景天苷能夠抑制其基因表達(dá)。補(bǔ)體激活被認(rèn)為是調(diào)控組織促發(fā)炎癥進(jìn)一步損傷的關(guān)鍵因素[12],抑制補(bǔ)體成分能夠有效減輕腦缺血/再灌注的損傷[5]。補(bǔ)體成分C3處于補(bǔ)體激活途徑的匯合點(diǎn),并為替代途徑激活的關(guān)鍵分子,在補(bǔ)體系統(tǒng)的激活中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)免疫熒光染色結(jié)果顯示,補(bǔ)體成分C3在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá),此結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的補(bǔ)體的生物合成也發(fā)生在大腦中相吻合[13]。同時(shí),本研究發(fā)現(xiàn)紅景天苷能夠抑制補(bǔ)體成分C3的表達(dá),促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志物NeuN的表達(dá),該結(jié)果提示,紅景天苷能夠抑制C3,降低補(bǔ)體系統(tǒng)的過度激活,抑制炎癥的發(fā)生,減少炎癥對(duì)腦組織的再次損傷,減少神經(jīng)細(xì)胞的死亡,從而起神經(jīng)保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),紅景天苷能夠抑制補(bǔ)體中樞成分C3的表達(dá),為本課題組進(jìn)一步研究紅景天苷對(duì)補(bǔ)體途徑的作用機(jī)制奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

(致謝:本實(shí)驗(yàn)在福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院生物醫(yī)藥研發(fā)中心及省級(jí)中藥學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成,感謝所有老師及同學(xué)的支持與幫助!)

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紅景天,紅景天
——題《圣山系-金巔》
HPLC法同時(shí)測定3種紅景天藥材中5種化學(xué)成分的含量