林 軍，梁 萍，黃 清，李 沖，農(nóng)立宇，黃建敏，李雪斌，蒙蘭青

（右江民族醫(yī)學院，廣西 百色 533000）

三七總皂苷（PNS）是我國名貴中藥三七的有效活性成分，治療腦梗死的臨床療效明顯[1]。局灶性腦缺血時，神經(jīng)血管單元（NVU）中的神經(jīng)元、膠質細胞和微血管均受到損傷[2]，因此缺血性腦損傷是多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑的損傷，尋求對腦缺血損傷后有整合作用的藥物很有意義。本研究中建立了大鼠局灶性腦缺血再灌注模型，觀察大鼠缺血灶周邊腦組織NVU超微結構及相關的神經(jīng)核抗原（NeuN）、膠質纖維酸性蛋白（GFAP）和層粘連蛋白（LN）在不同時間點的表達變化，以探討PNS對腦缺血后NVU的影響，闡明PNS在腦缺血治療中的整合作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

動物：SD雄性大鼠144只，SPF級，體質量250～300 g，由廣西醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號為SCXK（桂）2014-0002，實驗動物使用許可證號為SYXK（桂）2011-0010。飼養(yǎng)于SPF級動物實驗室。

儀器與試藥：H-7650型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；電轉儀（美國Bio-Rad公司）。三七總皂苷[注射用血栓通（凍干），廣西梧州制藥（集團）股份有限公司，國藥準字Z20025652，批號為15090707，規(guī)格為每支100 mg、150 mg、250 mg]。戊二醛固定液（電鏡專用，2.5%），4%多聚甲醛（北京 Solarbio公司）；RIPA裂解液，BCA蛋白定量（增強型）試劑均購于碧云天生物技術有限公司；兔抗NeuN抗體、兔抗GFAP抗體、兔抗betaActin抗體均購于武漢Proteintech公司；兔抗Anti-Laminin抗體（ab11575，美國 Abcam 公司）。

1.2 方法

分組與給藥：將144只大鼠隨機分為假手術組、模型組和治療組，各48只；各組又分別按腦缺血再灌注后 24 h、72 h、7 d、3周分為 4個亞組，各 12只。治療組大鼠在術后4 h神經(jīng)功能評分后即給予三七總皂苷50 mg/kg腹腔注射，之后每日1次，直到相應的時間點；模型組和假手術組大鼠在相同時間點給予同體積0.9%氯化鈉注射液腹腔注射。

局灶性大腦中動脈閉塞（MCAO）模型制作：模型組和治療組大鼠參考文獻[3]線栓法并加以改良，制作局灶性MCAO模型。假手術組栓線頭插頸內動脈深度為8～10mm，未造成缺血。

神經(jīng)功能評分：術后3～4 h大鼠基本蘇醒，應用Longa評分標準評分[3]，1～3分為制模成功。隨之各組進行干預，分別在缺血再灌注后24 h、72 h、7 d、3周時對3組中各亞組12只模型大鼠再次進行評分。

蛋白免疫印跡法（WB）標本采集及檢測：分別在缺血再灌注后24 h、72 h、7 d、3周4個時間點對3組大鼠神經(jīng)功能評分，各組隨機取6只大鼠，腹腔麻醉，斷頭取腦，于冰上剪取缺血灶周邊相應位置腦組織，剪碎，置含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液中研磨勻漿，4℃下13 000 r/min離心5 min，取上清液，用BCA法檢測蛋白濃度。各組取20 μg蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳，將電泳后的蛋白電轉于PVDF膜上，封閉液封閉60 min，按適當比例將各個一抗與一抗稀釋液稀釋[NeuN抗體 1∶500～1∶5 000，GFAP抗體 1∶500～1∶5000，Anti-Laminin抗體（ab11575）1∶200～1∶1000，β-actin抗體 1∶1 000～1∶10 000]，4℃孵育過夜，TBST洗膜后，將膜與HRP-山羊抗兔二抗（二抗用稀釋液按照1∶5 000比例稀釋）室溫搖床孵育1.5 h，然后TBST洗滌，采用ECL化學發(fā)光法顯影、定影，利用Image J軟件分析條帶的灰度值，計算目的蛋白（NeuN，GFAP，LN）與內參蛋白β-actin二者灰度值的比值。

電鏡標本采集及檢測：取3組剩余大鼠，腹腔麻醉，開胸，充分暴露心臟，從左心室向升主動脈插入灌注針，剪破右心耳，放靜脈血，快速灌注100 mL生理鹽水，大鼠肝臟變白，右心房流出液清亮時即可換預冷的4%多聚甲醛200 mL灌注，大鼠后肢繃直，尾巴豎起，表明固定成功。斷頭取腦，分別從右側缺血灶周邊腦組織相應部位各取組織塊，切成約1 mm×1 mm×1 mm小塊，放入2.5%戊二醛固定液，于4℃避光固定24 h。按常規(guī)電鏡檢測標本制備程序逐步進行，漂洗、脫水、浸透及環(huán)氧樹脂包埋。超薄切片，片厚約50 nm，切片醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛雙染色，采用H-7650型透射電鏡下觀察腦組織超微結構變化并進行攝片。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS13.0統(tǒng)計學軟件處理。計量數(shù)據(jù)以表示；組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評分

結果見表1?？梢?，干預前（即術后4 h）治療組和模型組神經(jīng)功能評分比較無明顯差異（P＞0.05）；干預后治療組大鼠神經(jīng)功能評分逐漸改善，比同時間點模型組明顯降低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（± s，分，n=12）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分比較（± s，分，n=12）

注：與模型組24 h亞組比較，△P＞0.05；與同時間點模型組比較，▲P＜0.05。

組別24 h亞組 72 h亞組 7 d亞組 3周亞組假手術組模型組治療組干預前0 2.00±0.60 1.92±0.63 24 h干預后0 2.00±0.60 1.83±0.65△干預前0 1.83±0.65 1.83±0.65 72 h干預后0 1.92±0.63 1.08±0.36▲干預前0 1.92±0.63 1.92±0.63 7 d干預后0 1.50±0.43 0.92±0.36▲干預前0 2.00±0.60 2.00±0.60 3周干預后0 1.33±0.39 0.71±0.26▲

2.2 蛋白免疫印跡檢測結果

NeuN蛋白：模型組各時間點NeuN蛋白表達均低于假手術組，其中24 h、7 d、3周表達相對于假手術組差異顯著（P＜0.05）；相比模型組，治療組NeuN的表達量逐漸升高，在IR 72 h后基本接近正常，7 d、3周表達差異顯著（P＜0.05）。詳見圖1 A及圖2 A。

圖1 不同時間點各組蛋白免疫印跡檢測結果

圖2 不同時間點各組大鼠腦組織灰度值比較（± s，n=6）

GFAP蛋白：GFAP蛋白相對表達量，模型組逐漸增加，各時間點表達均低于假手術組（P＜0.05）；與模型組相比，治療組各時間點較模型組升高，其中72 h、7 d、3周表達差異顯著（P＜0.05），至 IR 7 d后，治療組GFAP蛋白表達基本接近正常。詳見圖1 B及圖2 B。

LN蛋白：模型組LN蛋白表達量逐漸增加，各時間點表達仍低于假手術組，24 h、72 h、7 d相比假手術組差異顯著（P＜0.05）；治療組各時間點LN蛋白表達量較模型組高，其中7 d、3周與模型組相比差異顯著（P＜0.05）。詳見圖1 C及圖2 C。

2.3 大鼠腦缺血灶周邊NVU超微結構變化

神經(jīng)元：見圖3 A。各時間點，假手術組神經(jīng)元無變化，胞核大，圓形或橢圓形，核仁清晰可見，著色深，多位于中央，染色質均勻分布，核膜清晰完整；細胞膜結構完整；胞質內細胞器豐富，結構正常。隨時間的延長，模型組神經(jīng)元超微結構不同程度的破壞，胞核變形、伴有切跡甚至破裂皺縮，核仁邊聚或消失，核膜有模糊或斷裂，細胞器開始腫脹伴空泡狀，有溶解空白區(qū)，甚至結構疏松減少。治療組神經(jīng)元胞核形態(tài)尚可、核膜完整不斷裂、核仁大部分可見，細胞器結構狀態(tài)好于模型組同時間點表現(xiàn)。

膠質細胞：各時間點，假手術組膠質細胞無改變，輪廓清晰，結構完整，胞核呈卵圓形，核膜正常，染色質分布均勻，染色略深，細胞器結構正常、清晰。隨時間的延長，模型組膠質細胞超微結構有不同程度的破壞，胞核不同形狀變形，染色質大部分邊聚多見，核膜72 h開始模糊不清，細胞器可見空泡狀或空白區(qū)、有溶解甚至結構破壞疏松。治療組膠質細胞的細胞核形態(tài)優(yōu)于模型組、核膜完整清晰，細胞器結構狀態(tài)好于模型組同時間點表現(xiàn)。詳見圖3 B。

微血管：各時間點假手術組微血管無變化，周圍無水腫，間隙致密無擴大，管壁光滑，管腔正常，內皮細胞結構正常，基底膜連續(xù)、薄厚均勻。模型組微血管內皮細胞逐漸出現(xiàn)變形甚至有空泡，管腔不同程度狹窄，血管周圍不同程度溶解伴水腫、72 h較明顯，可見空泡狀或空白區(qū)。治療組微血管內皮細胞變形不明顯、管腔基本通暢、管周水腫較模型組減輕，細胞器結構狀態(tài)好于模型組同時間點表現(xiàn)。詳見圖3 C。

3 討論

目前，對腦損傷的研究焦點逐漸從單一的神經(jīng)元轉向神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞和微血管等組成的復合體，即NVU。該概念于2002年由美國神經(jīng)疾病與卒中研究所首次提出[4]，強調NVU中三者間相互聯(lián)系、相互作用的重要性。NVU各成分之間存在復雜的信號偶聯(lián)和傳遞，任何一組分的破壞都會影響到NVU的整體功能[5]。局灶性腦缺血時，不僅是神經(jīng)元受損害，提供神經(jīng)元氧和能量的微血管及起支持功能的膠質細胞也同時受到損傷[2]，對缺血性腦損傷的研究應把神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞和微血管視為整體進行研究。腦缺血涉及多種不同類型細胞的功能障礙，單純對神經(jīng)細胞保護或單個靶點治療難以達到充分的保護效果[6]，因此神經(jīng)保護治療的目標應是同時對NVU中膠質細胞、微血管的整體保護。

三七總皂苷對腦缺血具有多靶點、多方位作用。ZHOU等[7]發(fā)現(xiàn)，PNS可通過抗氧化降低大鼠腦皮層星形膠質細胞死亡。徐士欣等[8]發(fā)現(xiàn)，PNS能對腦缺血再灌注損傷早期發(fā)揮神經(jīng)保護效應，可能與顯著抑制血腦屏障破壞相關的蛋白表達水平有關，為PNS干預腦缺血后對血腦屏障損傷起一定保護作用提供實驗依據(jù)。PNS通過抑制細胞凋亡，對腦缺血治療后能促進神經(jīng)元形態(tài)恢復和數(shù)量增加[9]。PNS可通過干預腦缺血性損傷的多個級聯(lián)病理反應，從而防護腦缺血性損傷。

圖3 各組大鼠神經(jīng)元血管單元電鏡下超微結構

NeuN被認為是成熟神經(jīng)元的特異性標志物，其蛋白表達逐漸上調，可反映神經(jīng)細胞成熟程度[10]。SHARP等[11]選用沙鼠短暫性腦缺血模型來研究海馬、齒狀回部位新生成的細胞，通過BrdU標記新生成的分裂細胞，發(fā)現(xiàn)腦缺血后1個月有2/3的細胞表達出現(xiàn)成熟神經(jīng)元的標志物NeuN，表明腦缺血后內源性的神經(jīng)干細胞或前體細胞被增殖分化，從而進行修復神經(jīng)元結構及功能重塑。本試驗中經(jīng)PNS干預后NeuN的表達量逐漸升高，同時電鏡觀察到神經(jīng)元形態(tài)學較模型組損傷減輕，考慮是NeuN對神經(jīng)元結構和功能起到修復、重塑作用的結果，表明PNS能保護神經(jīng)元存活，可能與上調NeuN蛋白表達有關。

GFAP被認為是活化狀態(tài)星形膠質細胞特有的標志物[12]。GOMES等[13]的研究表明，上調 GFAP表達水平可促進腦組織損傷的修復，提示GFAP可能有誘導星形膠質細胞對腦缺血損傷起修復作用。本研究結果顯示，PNS可上調腦缺血后GFAP蛋白表達，電鏡觀察到膠質細胞的細胞核形態(tài)好于模型組，核膜完整清晰，說明GFAP可對缺血損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用，與文獻[13]報道大致相符，提示PNS可能與上調GFAP蛋白表達而發(fā)揮神經(jīng)保護作用有關。

LN是檢測血管基底膜完整性的敏感指標，具有調控細胞增殖、黏附，促進血管新生的作用[14]。本研究中治療組LN的表達量較模型組逐漸升高，電鏡觀察到微血管管周水腫較模型組逐漸減輕，細胞器結構狀態(tài)好于模型組同時間點表現(xiàn)，表明了LN增多能促進血管新生，對微血管起到修復作用，與施浩[14]的研究結果大致相似，提示PNS可能與上調LN表達起微血管修復作用。

腦缺血后可導致NVU損傷，主要表現(xiàn)在NVU結構完整性的改變。細胞超微結構變化是反映細胞損傷程度甚至死亡最直觀的指標[15]。HAN等[16]在大鼠腦缺血再灌注模型研究中選擇電鏡技術能細微地觀察到腦損傷后神經(jīng)元、星形膠質細胞及微血管三者的超微結構變化。通過透射電子顯微鏡不僅同時觀察到大鼠腦缺血后NVU的神經(jīng)元、內皮細胞、血管基底膜及血管周邊的膠質細胞超微結構的完整性破壞，發(fā)現(xiàn)周細胞損傷的同時伴隨著線粒體嵴的腫脹破壞，血管損傷性水腫[17]。利用電鏡技術對阿爾茨海默病的老年患者腦組織中神經(jīng)元、膠質細胞及毛細血管觀測，不僅能清晰觀察到三者同時出現(xiàn)細微結構改變，也發(fā)現(xiàn)血管壁與鄰近神經(jīng)元和星形膠質細胞之間在功能和形態(tài)上有著相互作用[18]。因此，電鏡不僅可同時觀察NVU中三者的細微形態(tài)結構，還能觀察NVU各組分間相互關聯(lián)的病理形態(tài)學改變。提示電鏡技術是目前觀察和研究NVU超微結構最直接、最客觀的方法。

本研究選用電鏡同時觀察腦缺血后NVU中神經(jīng)元、神經(jīng)膠質細胞和微血管的動態(tài)超微病理形態(tài)改變的研究，目前尚未見相關報道。電鏡結果顯示，與模型組相比，各PNS治療組大鼠腦細胞神經(jīng)元、膠質細胞和微血管的病理形態(tài)改變均有所改善，提示PNS能同時減輕腦缺血再灌注后NVU的病理形態(tài)改變，這與文獻[19]報道結果大致符合；治療組大鼠神經(jīng)功能評分與模型組相比逐漸改善，神經(jīng)功能缺失癥狀也逐漸減輕，有臨床研究表明，神經(jīng)功能的缺失是最直接的評價腦梗死后神經(jīng)損傷輕重的指標[20]，說明PNS干預后可改善腦缺血再灌注后大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，減輕腦缺血后損傷。神經(jīng)功能評分和病理形態(tài)學是評價藥物抗腦缺血效應的指標[19]，表明三七總皂苷可通過整合促進腦缺血后NVU神經(jīng)元、膠質細胞和微血管的修復，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，對腦缺血具有保護作用。