雷 陽，成 妍，喬 寧，焦彥生，苗如意，楊玉花

(1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蔬菜研究所，山西 太原 030031；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)作物品種資源研究所，山西 太原 030031)

辣椒疫病(Phytophthorablight)是由辣椒疫霉菌(PhytophthoracapsiciLeonian)引起的一種土傳病害[1]，而辣椒疫霉菌是一種重要的植物病原卵菌，為害茄科、葫蘆科和豆類等多種農(nóng)作物以及可可樹等梧桐科植物。辣椒疫病是世界范圍內(nèi)最具破壞性的疾病之一[2]，在適宜條件下，其會導(dǎo)致辣椒產(chǎn)量急劇降低，輕者減產(chǎn)20%～30%，重者減產(chǎn)90%，甚至絕收。目前，山西辣椒種植面積約5萬hm2，由疫病引起的辣椒產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降、效益下滑的問題已直接威脅到辣椒產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。因此，開展辣椒抗疫病轉(zhuǎn)錄組的研究對育種工作者針對抗性材料的篩選和改良具有必要性和緊迫性。

辣椒疫病在辣椒整個生育期均可發(fā)生，葉片受到辣椒疫霉菌侵染時，病斑呈現(xiàn)圓形或近圓形，然后逐漸擴(kuò)展到葉片邊緣，導(dǎo)致葉片軟腐并呈現(xiàn)黃綠色；花受侵染后變褐、脫落；受到其侵染時果蒂最先開始發(fā)病，最終霉?fàn)€[3]。辣椒疫病的發(fā)生以及流行主要與辣椒疫霉菌生長的環(huán)境條件密切相關(guān)，主要包括溫濕度、栽培土壤的類型以及栽培方式等。辣椒疫霉菌主要以菌絲、厚垣孢子等形式在寄主植物的病株殘體、土壤、種子或其他寄主上越冬并存活下來，成為第2年的初侵染源。等到第2年條件適宜時，辣椒疫霉菌借助雨水或風(fēng)力等外界傳播媒介侵入寄主植物體內(nèi)的各個部位，從而引起病害發(fā)生[4-5]。近年來，國內(nèi)外關(guān)于辣椒疫病抗性育種工作研究不斷深入，結(jié)果表明，抗辣椒疫病是由多基因控制。因此，只有通過聚合高抗辣椒疫病品種優(yōu)良基因，才能選育出較好的抗疫病辣椒品種。目前，辣椒基因組測序的完成以及分子標(biāo)記技術(shù)和高通量轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)技術(shù)的不斷進(jìn)步[6]，為辣椒抗疫病育種打下扎實的分子基礎(chǔ)，特別是新一代轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的發(fā)展對辣椒育種研究起到了巨大的推動作用，該技術(shù)可以在特定組織或細(xì)胞的某個時期來研究基因功能及結(jié)構(gòu)。前人已經(jīng)利用轉(zhuǎn)錄組測序方法研究了辣椒的一些性狀，如對辣椒雄性不育轉(zhuǎn)錄組測序分析[7]，辣椒果實不同形態(tài)(鈴形和牛角形)轉(zhuǎn)錄組測序分析[8]。其中，Wang等[9]對辣椒抗疫病材料PI201234轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序分析，結(jié)果篩選到204個抗病基因，其表達(dá)模式包括細(xì)胞壁修飾、植保素合成、激素信號和轉(zhuǎn)錄調(diào)控4個方面。因此得出，利用RNA-seq技術(shù)可以快速全面發(fā)現(xiàn)特定組織、特定細(xì)胞內(nèi)起重要功能的基因，從而為育種工作奠定基礎(chǔ)。

目前，辣椒疫病危害巨大，其已被全球辣椒育種工作者高度重視。雖然，對辣椒疫病的抗性機(jī)制研究已有數(shù)十年，但到目前為止，抗病基因還未被全部克隆，相關(guān)抗病機(jī)理依然模棱兩可。

本研究利用RNA-seq分子生物學(xué)技術(shù)，從114份辣椒資源中篩選出對辣椒疫病產(chǎn)生抗性的相關(guān)基因，旨在今后的研究中可用來快速分辨辣椒資源的抗性，加快抗病育種進(jìn)度和辣椒抗疫病新品種的更新?lián)Q代，其對促進(jìn)辣椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展和農(nóng)民增收具有重要的意義。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究所用的辣椒材料均由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所搜集并提供。在播種前選擇籽粒飽滿、顏色和大小一致的辣椒種子，首先在55 ℃溫水中浸種20 min，然后將種子均勻鋪在裝有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于溫度為28 ℃、相對濕度為60%的全黑暗人工氣候箱中進(jìn)行催芽。大約在80%的種子露白后，就可以將其播在裝有基質(zhì)(腐殖質(zhì)∶珍珠巖=3∶1)的穴盤中，于山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院東陽基地大棚中進(jìn)行培養(yǎng)。每個材料設(shè)置 3個重復(fù)，每個重復(fù)種植10株。

辣椒疫霉菌菌株由山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所保存并提供。首先將保存的病原菌進(jìn)行復(fù)壯，在超凈工作臺上將保存于石蠟油中的菌絲接種到PDA固體培養(yǎng)基(300 g馬鈴薯削皮切片，加入18 g瓊脂、20 g葡糖糖，置于微波爐中煮30 min(每10 min攪拌一次)，然后用紗布過濾去除殘渣，最后蒸餾水定容至1 000 mL)上進(jìn)行活化，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d[10]。待白色菌落形成后置于光下進(jìn)行孢子囊的誘導(dǎo)，大約2 d后，將產(chǎn)生的孢子囊刮到無菌水中，4 ℃下1 h，而后28 ℃下30 min促使游動孢子的釋放。用高溫滅菌的紗布過濾，收集下層的濾液，然后在血球計數(shù)板上計數(shù)，用無菌水調(diào)整成最終濃度為 1×104個/mL的孢子懸浮液，備用。

待辣椒苗長出4片真葉后，移入整理好的苗圃內(nèi)，并做好標(biāo)號。長出6～8片真葉時，采用灌根法對其進(jìn)行疫霉菌接種。本試驗采用的接種方法為灌根接種法[11]。接種15 d后，按農(nóng)業(yè)部1999年頒布的分級標(biāo)準(zhǔn)調(diào)查辣椒發(fā)病級別(表1)。

表1 辣椒疫病分級標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 The standard classification of pepper Phytophthora blight

1.2 試驗方法

1.2.1 田間取樣和RNA提取 灌根15 d后調(diào)查植株發(fā)病情況，發(fā)現(xiàn)L1、L2和L4這3個材料屬于高感辣椒疫病材料，病級屬于4～5級；L3屬于高抗辣椒疫病材料，完全不發(fā)病，病級為0級。每個材料分別取10株混合樣，迅速置于液氮中冷凍，然后放在-80 ℃的超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

利用TRIzol(Invitrogen，USA)試劑提取辣椒L1、L2、L3和L4整株混樣總RNA，然后利用RNase-free DNase Ⅰ(Thermo Scientific，USA)除去總RNA中殘余的DNA。利用NanoDrop 2000(Thermo Scientific，USA)分光光度計檢測提取辣椒總RNA的濃度和純度。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組文庫構(gòu)建及高通量測序 將提取的4個辣椒樣品L1、L2、L3和L4的總RNA，參考劉峰等[8]的方法構(gòu)建特異性文庫。文庫構(gòu)建完成后，采用PCR擴(kuò)增進(jìn)行文庫片段富集，文庫大小一般在300～400 bp。然后參考Chen等[7]的方法進(jìn)行Agilen及文庫有效濃度檢測，樣品經(jīng)過RNA抽提、純化、建庫之后，送往生工生物工程(上海)有限公司，采用Illumina RNA-seq測序平臺，對文庫進(jìn)行雙末端測序。樣品經(jīng)測序后生成FASTQ格式的原始數(shù)據(jù)，然后經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾，要求平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于Q20。最后采用FastQC對數(shù)據(jù)進(jìn)行單堿基質(zhì)量、Base Content分布、GC Content分布、Sequence Base Quality 4個指標(biāo)的質(zhì)控分析。

1.2.3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)分析 將測序過濾后數(shù)據(jù)與參考基因組Pepper_Zunla_1_Ref_v1.0(NCBI)進(jìn)行比對，根據(jù)基因組注釋信息，可得到序列的來源基因以及表達(dá)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。然后基于比對到基因的序列數(shù)目，用統(tǒng)計學(xué)方法計算表達(dá)量，并進(jìn)一步比較基因、轉(zhuǎn)錄本和外顯子在不同樣品和分組之間的表達(dá)差異[8]。采用 RPKM(Reads Per Kilo bases per Million reads)對基因的表達(dá)量進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，并在此基礎(chǔ)上以FDR≤0.001和|log2Ratio|≥1為條件篩選出2組樣本間差異表達(dá)基因。目的是為了能夠在樣品內(nèi)以及樣品間比較基因的表達(dá)量。其計算公式如下：

①

1.2.4 Real time-PCR 為了鑒定Illumina測序后篩選出的差異基因的不同表達(dá)模式，隨機(jī)選擇20個差異基因，然后利用qRT-PCR進(jìn)行驗證。首先使用 Primer 5.0 設(shè)計引物，盡可能跨內(nèi)含子/外顯子邊界，以避免在實時定量RT-PCR時擴(kuò)增基因組DNA。每個樣品取3.0 μg 總RNA，利用TaKaRa公司 PrimeScript @ Reverse Transcriptase 試劑盒(商品編號：D2680A)方法(參考說明書)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用大豆β-actin基因設(shè)立陽性對照，根據(jù) TaKaRa公司SYBR@ Premix ExTaqTM(Tli RNaseh Plus)(商品編號為 DRR420S)說明書進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)(ABI 7 300)，每個反應(yīng)重復(fù) 3 次，最后利用2-ΔΔCT方法分析結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 四份辣椒材料在苗期的抗病性鑒定

將山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒課題組收集的114份辣椒材料/品種，在幼苗長至6～8片葉時，接種辣椒疫霉菌。接種7 d后，按照農(nóng)業(yè)部1999年頒布的0～5級6個抗病分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病級統(tǒng)計。結(jié)果顯示，辣椒疫病6個病級，每級材料份數(shù)分別為3，7，11，25，36，32(圖1)。由此可以看出，抗辣椒疫病的材料較少，感疫病材料較多。本研究從0級抗病的3份材料中選擇1份抗病材料L3，從5級感病的32份材料中選擇L1、L2、L4這3份感病材料進(jìn)行后期深入研究。

圖1 辣椒田間病級統(tǒng)計結(jié)果Fig.1 The statistics result of disease pepper in field

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測

4份辣椒材料苗期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計和質(zhì)量檢測如表2，3所示。由表2可知，本次測序試驗共獲得177 238 390條的 reads，總堿基數(shù)為26.59 Gb，每個樣品均獲得6.2 Gb以上的堿基。其中，Q20在97%以上，Q30在93%以上，GC含量均占43%。說明試驗轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量具有較高的可信度，可用于后續(xù)數(shù)據(jù)分析。經(jīng)過對原始總數(shù)據(jù)質(zhì)量過濾后，L1、L2、L3和L4這4份樣本的Clean數(shù)據(jù)與表2中的數(shù)據(jù)量相比均有所下降，篩選后的有效數(shù)據(jù)量均在98%以上(表3)，平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)不低于Q20。

利用Tophat/Tophat2(基于Bowtie/Bowtie2)軟件成功地將82.66%～89.99%的Clean數(shù)據(jù)比對到辣椒參考基因組(http：//www.ensembl.org/)，并且有78.95%～85.11%的Clean數(shù)據(jù)比對到唯一的基因組位點(diǎn)(表4)。說明4個樣品的Clean數(shù)據(jù)與參考基因組的比對效率較高。

表2 測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Tab.2 The statistical results of sequencing data

注：Qx 指質(zhì)量值大于或等于x的堿基所占的百分比。

Note：Qx means the percentage of quality value greater or equal to x base.

表3 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測Tab.3 The result of transcriptome sequencing data

表4 四份辣椒材料RNA轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果與辣椒參考基因組比對統(tǒng)計Tab.4 Statistics of RNA-seq for pepper phytophthora blight of four pepper genotypes referring to pepper genome

2.3 辣椒抗疫病和感疫病2組材料差異表達(dá)基因分析

依據(jù)4份材料間的差異基因表達(dá)水平進(jìn)行PCA主成分分析，將相似材料進(jìn)行聚類，結(jié)果顯示，L3的值遠(yuǎn)高于在同一組的L1、L2和L4這3份材料(圖2-A)，表明前期在材料篩選中足夠精確，試驗設(shè)計也合理。采用 DESeq(Version 1.18.0)方法對辣椒抗疫病和感疫病2組材料間基因表達(dá)進(jìn)行差異分析，通過成對比較可以消除基因型特異性轉(zhuǎn)錄組的背景干擾，從而獲得與抗病和感病相關(guān)的更多數(shù)據(jù)。首先篩選抗病和感病2個材料間的差異表達(dá)基因條件為：表達(dá)倍數(shù)差異 |log2fold-change|>1，顯著性P-value<0.05。依據(jù)這2個標(biāo)準(zhǔn)，將感病組的L1、L2和L4 這3個材料分別與抗病材料L3相比，結(jié)果顯示，分別得到1 127，1 165，1 062個顯著差異表達(dá)基因，其中，上調(diào)基因分別為364，375，713個，下調(diào)基因分別為763，790，349個(表5)，有331個基因在 3組比對結(jié)果中均表現(xiàn)差異，包括68個上調(diào)基因和263個下調(diào)基因(圖2-B)。

圖2 四個辣椒材料PCA主成分分析圖(A)和差異基因表達(dá)維恩圖(B)Fig.2 PCA diagram of four pepper materials(A)and the Venn diagram showing the DEGs(B)

樣本Case參考樣本 Control上調(diào)表達(dá)基因Up-regulated genes下調(diào)表達(dá)基因Down-regulated genes總差異表達(dá)基因Total DEGsL1L33647631 127L2L33757901 165L4L37133491 062

2.4 利用qRT-PCR 熒光定量驗證差異表達(dá)基因

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序分析的差異基因的可靠性，隨機(jī)從2組材料篩選出的差異表達(dá)基因中挑選10個差異基因(包括5個上調(diào)基因和5個下調(diào)基因)(表6)，采用熒光定量qRT-PCR技術(shù)進(jìn)行表達(dá)驗證，結(jié)果顯示，熒光定量qRT-PCR檢測的隨機(jī)選擇的10個差異基因在4份辣椒材料中的表達(dá)模式與RNA-seq分析結(jié)果高度相似，進(jìn)而證實，轉(zhuǎn)錄組測序8個基因的表達(dá)水平與RNA-seq結(jié)果一致，其中，107861905基因在L2中幾乎不表達(dá)，107862280基因在L3中的表達(dá)量反而高于其他 3份感病材料(圖3)。因此，可以證明RNA-seq分析結(jié)果可靠。

表6 RNA-seq分析的10個表達(dá)差異基因Tab.6 10 DEGs in the RNA-seq analysis of four pepper materials

2.5 差異基因功能顯著性富集分析

Gene Ontology(GO)富集分析能夠全面描繪差異基因和基因產(chǎn)物的功能屬性，因此將其用于評價辣椒抗疫病和感疫病相關(guān)表達(dá)具有顯著差異基因的功能。根據(jù)P<0.05 的閾值來選擇，結(jié)果顯示，14 624個差異表達(dá)基因被富集，占全基因組的46.58%，將預(yù)測的和已知的轉(zhuǎn)錄本分成 3組，包括分子功能轉(zhuǎn)錄本、細(xì)胞組成轉(zhuǎn)錄本和生化過程轉(zhuǎn)錄本。本研究具體分析在 3組比對中都表現(xiàn)出差異的331個差異基因，其中，有223個基因被GO富集、41個上調(diào)基因、182個下調(diào)基因。通過排列前10的 GO分類可以看出(表7)，上調(diào)差異基因和下調(diào)差異基因主要功能是分子功能和生化過程，而細(xì)胞組成分類很少。其中，分子功能主要子類有氧化還原酶活性、碳氧裂解酶活性、過氧化物酶活性等，而生化功能子類主要是代謝過程和逆境響應(yīng)過程。以上結(jié)果可以說明，差異基因編碼不同的酶類活性、代謝過程和逆境響應(yīng)，這些可能與辣椒抗疫病和感疫病差異相關(guān)的基因有關(guān)。

圖3 實時定量PCR驗證10個隨機(jī)選擇的差異表達(dá)基因Fig.3 Validation of 10 randomly chosen DEGs by qRT-PCR

與整個轉(zhuǎn)錄組背景相比，共有117個差異基因歸入KEGG通路，其中，包括25個上調(diào)差異基因，92個下調(diào)差異基因。在這些通路中，RNA退化、泛素介導(dǎo)的蛋白水解作用、氧化磷酸化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白處理和氨基酸的生物合成是上調(diào)差異基因?qū)?yīng)的前5個通路(表7)。而下調(diào)差異基因?qū)?yīng)的前5個通路，分別為植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、磷脂酶D信號通路、磷脂酰肌醇信號系統(tǒng)、黏液、氯烷烴和氯烯烴降解。因此，從整體觀察發(fā)現(xiàn)，辣椒抗疫病和感疫病差異基因主要集中于植物激素調(diào)節(jié)和蛋白調(diào)節(jié)等通路。將GO富集和KEGG富集結(jié)合起來分析發(fā)現(xiàn)，辣椒抗疫病和感疫病差異主要與酶類活性功能、逆境響應(yīng)過程相關(guān)，其次為結(jié)合蛋白代謝途徑、植物激素調(diào)節(jié)等過程。

表7 轉(zhuǎn)錄組測序分析中差異基因的GO子類詳細(xì)分析和KEGG通路分析Tab.7 The detailed GO subcategory analysis and KEGG pathways for DEGs in the RNA-seq analysis

3 結(jié)論與討論

本研究利用114份辣椒自然群體通過人工灌根法接種辣椒疫病，通過對病情的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，高抗材料較少，大多數(shù)材料都會感病，只是發(fā)病程度不一致。灌根法接種辣椒疫病這種方法理論上更符合大田病害發(fā)生實際侵染模式，基本上可模擬田間病害發(fā)生過程。

從篩選出的抗病和感病材料中選擇1份抗疫病材料L3和 3份感病材料L1、L2和L4進(jìn)行RNA-seq高通量測序分析。Illumina 高通量測序結(jié)果數(shù)據(jù)量大，并且試驗效率高，成本低，適合于辣椒疫病轉(zhuǎn)錄組測序研究。本研究共獲得了177 238 390條的reads，總堿基數(shù)為26.59 Gb，每個樣品均獲得6.2 Gb以上的堿基。有82.66%～89.99%的Clean數(shù)據(jù)比對到辣椒參考基因組上，并且有78.95%～85.11%的Clean數(shù)據(jù)比對到唯一的基因組位點(diǎn)，這一結(jié)果顯示，本研究高通量測序結(jié)果可靠，并且可以大量挖掘辣椒抗疫病過程中表達(dá)的重要基因。通過對辣椒抗病和感病的轉(zhuǎn)錄組比較分析，經(jīng)GO和KEGG差異基因功能顯著性富集分析，結(jié)果與前人研究辣椒疫病[12-15]、馬鈴薯疫病[16-19]等結(jié)果較一致。與辣椒疫病相關(guān)的基因功能主要表現(xiàn)為酶類、植物激素和泛素化等。通過抗病和感病成對比較L3/L1、L3/L2、L3/L4，結(jié)果顯示，3組樣本共同的差異基因331個，其中，68個上調(diào)基因，主要包含氧化還原酶活性、碳氧裂解酶活性、過氧化物酶活性、催化活性、代謝過程、蛋白酶負(fù)調(diào)節(jié)活性等相關(guān)基因；263個下調(diào)基因，主要包含氧化還原酶活性、氧化還原過程、逆境反應(yīng)、胞外區(qū)、防御反應(yīng)以及一些蛋白酶活性等相關(guān)基因。

過氧化物酶可以通過抑制真菌生長、清除過氧化氫，從而達(dá)到保護(hù)植物組織免受細(xì)胞損傷的作用。Alczar等[20]發(fā)現(xiàn)，接種辣椒疫病后，辣椒體內(nèi)過氧化物酶活性均升高，尤其是高抗病品種中增加的幅度最大；同時也發(fā)現(xiàn)，只在抗病品種細(xì)胞間檢測出過氧化物酶，說明在抗病品種中沿菌絲生長方向的過氧化物酶阻止了菌絲的迅速蔓延。同時Mozzetti等[21]研究也指出，過氧化物酶活性與辣椒疫病病情嚴(yán)重度相關(guān)。與辣椒疫病相關(guān)的酶類還有很多，如多酚氧化酶，將酚類物質(zhì)氧化為醌類物質(zhì)，并且聚合其為單寧類物質(zhì)，這樣就可以迅速殺死疫病侵入點(diǎn)周圍的細(xì)胞，從而達(dá)到抑制病原發(fā)生的目的。蛋白酶類通過磷酸化和去磷酸化可逆過程作為細(xì)胞信號，參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育以及應(yīng)答對環(huán)境的脅迫。

植物激素對辣椒疫病也有防御調(diào)控，主要有茉莉酸(JA)、乙烯(ET)和水楊酸(SA)等[22-24]。其中，JA在植物抗病反應(yīng)中是重要的信號分子，可誘導(dǎo)多酚氧化酶、苯丙烯酰苯合成酶、過氧化氨酶等防御蛋白的合成[25-27]。JA不僅是一種植物激素，同時也是植物抗性誘導(dǎo)劑，噴施JA等激素可以誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性，同時也能增加富含羥輔氨酸的糖蛋白的含量。也有人研究發(fā)現(xiàn)，JA能激活許多與植物防御相關(guān)的基因，如編碼抗真菌蛋白的植物防衛(wèi)素、硫素蛋白等合成的基因[28]。SA是植物免疫反應(yīng)中一個重要的信號分子，植物在受到病原菌侵染后，體內(nèi)SA含量顯著提高，可產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。ET途徑與JA途徑都可以調(diào)控擬南芥中抗病防衛(wèi)基因PDF1.2的表達(dá)，具有協(xié)同作用，同時二者還可抑制SA的合成，均與SA途徑存在拮抗作用。

泛素化也是植物參與抗病反應(yīng)的途徑之一，由泛素激活酶、泛素結(jié)合酶和泛素連接酶共同完成，其中，泛素連接酶能特異性識別病原物效應(yīng)蛋白并使其降解，是泛素化在植物抗病研究中的熱門和關(guān)注對象[29-31]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域和組成的差異，泛素連接酶可分為HETC型、RING/U-BOX型、Cullin-RING型和APC/C型，其中，Cullin-RING型和RING/U-BOX型泛素連接酶在植物抗病中具有重要作用[32]。Cullin-RING型泛素連接酶可通過特異性降解水楊酸(SA)途徑中調(diào)控蛋白NPR1、TGA2、NIMIN1等來介導(dǎo)SA抗病信號途徑[33-34]。Cullin-RING型泛素連接酶亞基F-box蛋白COI1可以介導(dǎo)植物的茉莉酸(JA)抗病信號途徑的傳導(dǎo)，對死體營養(yǎng)型病原物產(chǎn)生抗性[35]。編碼RING/U-BOX型泛素連接酶ATL基因在擬南芥、番茄和水稻中均發(fā)現(xiàn)，在免疫反應(yīng)中調(diào)控了對病原物的抗性[31]。一些具有泛素連接酶活性的U-BOX蛋白也已被證明具有調(diào)控植物細(xì)胞死亡、過氧化氫和茉莉酸含量，進(jìn)而影響植物免疫反應(yīng)的功能[36]。

辣椒對疫霉的免疫反應(yīng)是一個極其復(fù)雜、多途徑協(xié)同的過程，其中主要包括酶類活性調(diào)節(jié)、植物激素抗病信號途徑和泛素化。這些途徑在調(diào)控辣椒對病原物的抗性過程中除了行使其單一功能外，還互相影響參加其他途徑。說明辣椒對疫病的抗性并不是由個別基因所控制，而是一個系統(tǒng)性調(diào)節(jié)機(jī)制，需要大量的功能基因參與其中，這與本研究的轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果相契合。

研究通過高通量轉(zhuǎn)錄組測序，對辣椒抗疫病和感疫病2組材料進(jìn)行了比較深入的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，其結(jié)果可為在轉(zhuǎn)錄水平上全面了解辣椒抗疫病分子基礎(chǔ)提供有價值的參考。通過研究發(fā)現(xiàn)，辣椒抗疫病是一個高度復(fù)雜的過程，它由多個交叉通路調(diào)節(jié)，包括新陳代謝過程、酶活性調(diào)節(jié)、結(jié)合蛋白代謝、防御反應(yīng)及激素調(diào)節(jié)等，其結(jié)果為后期更深入研究辣椒抗疫病分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。