劉 靜，汪 雨，黃勁松，郭 軍

（1.宿州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，安徽宿州234000；2.池州學(xué)院化學(xué)與材料工程學(xué)院，安徽池州247000）

西山焦棗為鼠李科棗屬植物的成熟果實(shí)，是安徽省池州市貴池區(qū)特產(chǎn)，生長(zhǎng)在高海拔的皖南山區(qū)，清甜脆嫩，皮薄核小，肉質(zhì)細(xì)膩，含有較多糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、熊果酸、胡蘿卜素、維生素C、B族維生素、維生素P以及鈣、鐵、磷和環(huán)磷酸腺苷等營(yíng)養(yǎng)成分，具有益陽(yáng)補(bǔ)血，調(diào)理生機(jī)，養(yǎng)心定神，防止動(dòng)脈血管硬化等功效，其中棗多糖是生物活性多糖的一種[1，2]，研究表明多糖及其復(fù)合物對(duì)癌癥、免疫紊亂、糖尿病、肝損傷、高血壓、腦血栓等有顯著的療效，因此作為綠色膳食保健產(chǎn)品成分，具有廣闊的市場(chǎng)前景[3]。1983年，日本學(xué)者友田正司等用柱層析的方法，分離得到活性多糖，并對(duì)其分子組成結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。由于紅棗是我國(guó)的特色果品，國(guó)外學(xué)者研究較少，對(duì)其很多營(yíng)養(yǎng)功能性質(zhì)了解較少[4]，國(guó)內(nèi)對(duì)棗多糖的研究起始于1998年，林勤保[5]等分離純化得到中性多糖和酸性多糖并對(duì)其組分進(jìn)行分離研究，隨之國(guó)內(nèi)學(xué)者開(kāi)始對(duì)紅棗多糖進(jìn)行研究。超聲近年來(lái)被用于天然植物活性功能成分的提取[6-7]，其機(jī)理是利用超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈震蕩、空化、粉碎作用，將植物中的成分有效的傳遞到溶劑中去，該法簡(jiǎn)單、效率高，能達(dá)到比傳統(tǒng)提取更理想的效果[8-9]。

本研究采用超聲波作為輔助技術(shù)，結(jié)合單因素和正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，探討西山焦棗多糖的最佳提取工藝條件，為西山焦棗多糖多糖的研究開(kāi)發(fā)提供科學(xué)理論依據(jù)。此外對(duì)西山焦棗多糖的結(jié)構(gòu)、抗氧化性進(jìn)行初步測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑西山焦棗（安徽池州），葡萄糖（分析純），濃硫酸（分析純），苯酚（分析純），乙醇（分析純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)95%），氯仿（分析純），異戊醇（分析純）。（所有試劑均采購(gòu)國(guó)藥集團(tuán)）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器電子天平（YP202N）（上海菁海儀器有限公司），恒溫水浴鍋（HH-8，金壇市杰瑞爾電器有限公司）；可見(jiàn)分光光度計(jì)（722，上海奧普勒儀器有限公司），電熱恒溫鼔風(fēng)干燥箱（DH6-9243B5-lll，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司），低速離心機(jī)（常州國(guó)華電器有限公司），超聲波振蕩器（DL-820E，上海五相儀器儀表有限公司），恒溫磁力攪拌器（85-2，金壇市杰瑞爾電器有限公司），傅立葉變換紅外光譜儀（Nicolet iS-200，美國(guó)），透析袋（MD34-14，8000-1400，北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 焦棗多糖的制取工藝路線焦棗多糖的分離純化：焦棗粉→準(zhǔn)確稱重→熱水浸提→抽濾→第一次乙醇沉淀多糖→離心→去除蛋白質(zhì)→透析→第二次乙醇沉淀多糖→離心→烘干→焦棗多糖。

1.2.2 多糖純度的測(cè)定本實(shí)驗(yàn)利用苯酚-硫酸法來(lái)測(cè)定焦棗多糖的濃度，其原理為多糖類的成分在硫酸作用下，水解成單糖，脫水形成糖醛衍生物，和苯酚縮合成有色化合物，采用分光光度法，在最大吸收波長(zhǎng)490nm處，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出多糖的濃度；提取液中含有較多的單糖或雙糖，影響結(jié)果，因此本實(shí)驗(yàn)采用提取液濃縮醇沉再溶解的方法[10]，具體方法如下：

（1）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線：以葡萄糖為樣標(biāo)，精確稱取干燥恒重的葡萄糖25.0mg，定容至250mL，配制成100mg/L的葡萄糖溶液。取蒸餾水2mL為空白對(duì)照，取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL葡萄糖在比色管中加水至2.0mL，加入15%苯酚溶液1.0mL，搖勻，迅速加進(jìn)5.0mL濃硫酸，搖勻，靜置10min，置于沸水浴中加熱15min，取出用自來(lái)水冷卻至室溫，用蒸餾水的反應(yīng)液作空白對(duì)照，以最大吸收波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度A值，以A490作為縱坐標(biāo)，以葡萄糖的濃度為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線[10]。

依據(jù)分光光度法在波長(zhǎng)490nm處測(cè)定吸光度A490，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，得回歸方程為：A=0.083C-0.071R=0.987

A為吸光度；C為濃度（mg/L；R為線性相關(guān)系數(shù)

（2）多糖的提取率計(jì)算公式：

提取率（mg/L）=（C×稀釋倍數(shù)×V×10-6）/m

式中：C為分光光度計(jì)間接測(cè)定的焦棗多糖的濃度；單位：mg/L

V為提取液體積；單位：L

m為樣品質(zhì)量；單位：mg

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.2.3 焦棗多糖的純化

（1）乙醇沉淀：以體積1：4（濃縮液：沉淀劑）進(jìn)行沉淀。靜置2h，待沉淀析出，離心分離，將沉淀物烘干，得粗多糖。

（2)脫蛋白：稱量粗多糖樣品加水溶解至100 mL，加入氯仿-異戊醇（實(shí)驗(yàn)前先配成4：1體積比的混合溶液）25 mL，放置于萃取裝置之中，完全多次震蕩，獲取上層清夜，反復(fù)脫蛋白3次。

（3）透析除雜：將脫蛋白后的多糖溶液裝進(jìn)透析袋里面并放進(jìn)盛有蒸餾水的大容器內(nèi)，放于攪拌器上透析2～3天，乙醇沉淀，離心，低溫烘干，通過(guò)透析法除去有機(jī)溶劑、單糖、雙糖、萜、單寧以及無(wú)機(jī)鹽等一些雜質(zhì)，最后得到相對(duì)較純的棗多糖[11]。

1.2.4 焦棗多糖的紅外結(jié)構(gòu)表征 Nicolet iS-200，44個(gè)波數(shù)分辨率，掃描32次，KBr壓片制樣。

1.2.5 焦棗活性多糖對(duì)羥基自由基（?OH）的清除作用

原理：建立Fenton[12-13]體系。以EDTA Na2-Fe2+與H2O2反應(yīng)，反應(yīng)生成?OH，后者可氧細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖，損害細(xì)胞新陳代謝，產(chǎn)生有色物質(zhì)，分光光度計(jì)在532nm處有強(qiáng)吸收峰。當(dāng)有生物活性分子存在時(shí)，可延緩脫氧核糖的氧化，有色物質(zhì)生成量少；從而根據(jù)吸光度的大小，計(jì)算其半抑制濃度（IC50），以判斷活性物質(zhì)清除?OH的能力。

方法：配制不同濃度的Coixan標(biāo)品、焦棗多糖樣液，各取0.1mL于試管中，加入0.2mL EDTA Na2-Fe2+溶液(1mmol/L)和0.5mL的2-脫氧核糖溶液(1mmol/L)，用磷酸緩沖液(pH為7.4，濃度為0.1mmol/L)定容為 1.8mL，再加入0.2mL H2O2(10mmol/L)，在溫度為37℃，恒溫水浴中振蕩反應(yīng)30min后，先后加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.8%(w/w)三氯乙酸溶液1.0mL，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%(w/w)硫代巴比妥(TBA)溶液1.0mL，充分混合均勻后，沸水浴15min后，冷卻室溫為，測(cè)定吸光值A(chǔ)s。另外空白，同上處理，不加樣液，測(cè)定532nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)e；測(cè)定吸光值A(chǔ)O，最終清除?OH自由基的能力SA(%)計(jì)算式為：

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

影響浸提的因素主要有溫度、浸提時(shí)間、料液比、提取次數(shù)超聲功率，本實(shí)驗(yàn)從這四個(gè)因素來(lái)考慮對(duì)提取率的影響，為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平提供有價(jià)值的取值范圍。

圖2 超聲功率與提取率的關(guān)系

2.1.1 超聲波功率對(duì)提取率的影響 由圖2所示，設(shè)定溫度為80℃，提取時(shí)間為25min，料液比為30：1時(shí)，伴隨著超聲波功率的增加，焦棗多糖提取率也將漸漸增大，當(dāng)超聲波功率大于80W之后，提取率增加相對(duì)較少。當(dāng)功率超過(guò)90后提取率反而有所降低，可能原因?yàn)槌暪β侍岣邥r(shí)，水分子運(yùn)動(dòng)加速，能量傳遞被加強(qiáng)、擴(kuò)散，可溶性物質(zhì)溶解速度加快，功率過(guò)大時(shí)超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈機(jī)械波引起細(xì)胞內(nèi)部各種物質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，使棗多糖部分多糖降解。

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響 如圖3，設(shè)定溫度為80℃，提取功率為90W，料液比為30：1時(shí)，焦棗多糖提取率隨著浸提時(shí)間的增加而逐漸增加，當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)25min后，提取率增加不甚明顯，這說(shuō)明提取25min后，溶液中的多糖與焦棗中多糖濃度差變小，基本達(dá)到平衡狀態(tài)，繼續(xù)提取耗能、耗時(shí)間，因此浸提時(shí)間應(yīng)選在25min左右適宜。

圖3 浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響

2.1.3 料液比對(duì)提取率的影響 如圖4，設(shè)定溫度為80℃，提取功率為90W，提取時(shí)間為25min時(shí)，伴隨著液料比的增加，多糖的提取率也會(huì)漸漸增加，但當(dāng)液料比到達(dá)1：30后，多糖的提取率的增加就變得遲緩。而容積體積的增加會(huì)延長(zhǎng)濃縮時(shí)間，生產(chǎn)成本增加，所以液料比選擇在1：30左右較好。

圖4 液料比對(duì)提取率的影響

2.1.4 溫度對(duì)提取率的影響 設(shè)定提取功率為90W，液料比為30：1，提取時(shí)間為25min，由圖5可知，伴隨溫度的升高，多糖的提取率漸漸升高，表明溫度較低不利于多糖的提取，大多數(shù)植物多糖不易溶解于冷水中易溶于熱水，有利于多糖的浸出[14]。但由于溫度過(guò)高，如在80℃左右時(shí)，焦棗提取液的粘度變得過(guò)大，這也許應(yīng)該會(huì)有兩個(gè)原因：一是焦棗細(xì)胞在高溫下會(huì)處于“崩潰”、溶解的狀況；也有可能破壞有效成分，使多糖降解以及降低多糖活性，而導(dǎo)致提取率降低，而且溫度太高，還會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的浸提出的量增加，應(yīng)當(dāng)選在70℃～90℃之間為宜，這樣使后續(xù)處理更簡(jiǎn)單。

圖5 溫度對(duì)提取率的影響

2.1.5 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響 由圖6可知，多糖一次提取率5.2mg/L，隨著提取次數(shù)增加，多糖提取率逐漸減少，第五次提取提取率降到2.0mg/L，考慮到多次提取能耗較高，因此建議采用2次提取合并。

圖6 提取次數(shù)對(duì)提取率的影響

2.2 焦棗多糖的正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)之下，對(duì)多糖的提取工藝，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行了分析和優(yōu)化。熱水浸提法的單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)條件選擇具有針對(duì)性，縮短了實(shí)驗(yàn)的時(shí)間，摒除了水平數(shù)選擇的盲目性。正交實(shí)驗(yàn)使用的是三水平四因素的正交表L9(34)。

表1 水平因素

按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13]，共進(jìn)行9次提取，每次平行三次，結(jié)果如表2所示：各個(gè)因素影響多糖提取率的排列順序?yàn)椋阂蛩谻＞因素D＞因素B＞因素A，最佳的提取條件是：C2D3B2A3，也就是溫度90℃，超聲功率90w，浸提時(shí)間25min，料液比1：30，棗多糖的產(chǎn)率可達(dá)到5.58mg/L.溫度在90℃時(shí)候，水分子運(yùn)動(dòng)劇烈，使多糖運(yùn)動(dòng)加快，焦棗顆粒對(duì)多糖的束縛力減弱，多糖在胞內(nèi)和水溶液的滲透壓加大，因此溶液內(nèi)外濃度平衡較快。功率在90w時(shí)候，既可以不破壞細(xì)胞其它物質(zhì)，又可以快速的浸出多糖，浸提時(shí)間低于25 min時(shí)，胞內(nèi)外多糖無(wú)法達(dá)到平衡。時(shí)間大于25min時(shí)候，水熱能量將破壞多糖，引起講解。料液比大于1：30時(shí)候，溶液過(guò)稀，給后續(xù)濃縮帶來(lái)困難，料液比小于1：30時(shí)，包內(nèi)多糖難于浸出。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 紅外光譜圖鑒定

由圖在500—4000 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行的IR掃描，圖譜是具有糖類的特征吸收峰；在3200～3700cm-1范圍處出現(xiàn)一個(gè)較寬的峰，這是糖分子內(nèi)部或分子之間氫鍵O-H伸縮振動(dòng)引起的結(jié)果；2930 cm-1處的吸收是次甲基（-CH2）中的C-H伸縮振動(dòng)引起的；1630cm-1處的吸收峰應(yīng)為-CHO的C=O伸縮振動(dòng)引起，而1380cm-1處的峰很尖銳，屬于C-H變角振動(dòng)，它與C-H處的吸收伸縮振動(dòng)一同構(gòu)成了糖類的特征吸收峰。1110cm-1處的吸收峰是糖環(huán)的特征吸收峰，是由多糖中的C-O糖苷鍵振動(dòng)吸收引起的[15]。此譜圖表明實(shí)驗(yàn)所得物質(zhì)是焦棗多糖[16]。

圖7 多糖的紅外光譜圖

2.4 焦棗活性多糖的不同提取方法對(duì)羥基自由基（?OH）的清除作用

Fenton反應(yīng)是模擬生物體內(nèi)產(chǎn)生?OH的反應(yīng)。?OH是活性氧中反應(yīng)活性較高的自由基，對(duì)生物體有較大的危害，它可攻擊細(xì)胞膜導(dǎo)致?lián)p傷，或者破壞DNA，誘導(dǎo)DNA復(fù)制錯(cuò)誤，引起細(xì)胞突變和死亡，從而導(dǎo)致機(jī)體衰老、癌癥和其它疾病[17]。如圖7：本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了在超聲條件下和無(wú)超聲條件下提取的焦棗活性多糖對(duì)?OH清除能力。

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，對(duì)Fenton體系所產(chǎn)生的?OH，焦棗多糖具有良好的清除的能力，而且在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，超聲提取的焦棗多糖和熱水提取的焦棗多糖均呈現(xiàn)明顯遞增。其中超聲提取的焦棗多糖對(duì)?OH的清除能力優(yōu)于普通熱水水提法提取的焦棗多糖，二者消除?OH的IC50分別為0.48g/L與0.57g/L，差異顯著(p＜0.05)；而當(dāng)其濃度達(dá)到0.50g/L時(shí)，超聲提取的焦棗多糖對(duì)?OH的清除能力是無(wú)超聲提取的焦棗多糖的1.31倍，可能原因是普通熱水提取需要3 h左右，超聲提取方法極大的縮短提取時(shí)間，只需要0.5h，避免了多糖長(zhǎng)時(shí)間處于高溫環(huán)境，使多糖生物活性得到較大的保留[18-19]。

圖8 多糖對(duì)?OH的清除效果(n=3)

3 結(jié)論

通過(guò)最終優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，經(jīng)分析計(jì)算確定棗多糖的最佳工藝提取條件：溫度90℃，超聲功率90w，浸提時(shí)間25min，料液比1：30，浸提2次，棗多糖的產(chǎn)率可達(dá)到5.58 mg/L。在這些條件之中溫度的改變對(duì)多糖提取率的影響相對(duì)較大，然后依次為超聲功率、浸提時(shí)間、液料比。與傳統(tǒng)的水提取法相比，超聲波輔助法能夠提高多糖的的提取效率，縮短時(shí)間，節(jié)省能量；此外，超聲波輔助提取的棗多糖有較強(qiáng)的清除自由基能力，具有明顯的抗氧化。目前此方法僅限于實(shí)驗(yàn)室提取棗多糖，對(duì)于進(jìn)一步對(duì)其生物體內(nèi)的生物活性的研究，研究工作需進(jìn)一步不斷深入。