謝 振 資鵬鵬 游清徽 蔡險峰

（江西師范大學生命科學學院食品與生物技術產(chǎn)學研合作示范基地 江西南昌 330022）

“維生素C 的定量測定”是經(jīng)典的生物化學實驗之一，實驗教學中常采用2，6-二氯酚靛酚滴定法和碘滴定法，但滴定法易受蔬菜和水果中色素的影響而難以判斷滴定終點［1］，且不能排除樣品中還原性雜質(zhì)的干擾，從而增加實驗教學難度。磷鉬酸法相比于滴定法，具有抗顏色干擾強、專一性高、反應迅速、操作簡單等優(yōu)點，更符合實驗教學的要求。但王源秀等［2］指出在實驗過程中混合的試劑在30℃水浴時易形成黃色沉淀而影響比色結果，這一缺點限制了磷鉬酸法作為“Vc 的定量測定”教學實驗方法。

目前，關于磷鉬酸法測定Vc 含量的研究多集中在實驗條件的優(yōu)化，不同材質(zhì)的試管對實驗中黃色沉淀產(chǎn)生時間的影響鮮有報導。本文選用質(zhì)地堅硬且透明的玻璃試管、聚丙烯塑料（PP）試管和聚苯乙烯塑料（PS）試管，作為磷鉬酸法測定Vc含量實驗的反應容器，探究3 種不同材質(zhì)試管對實驗中沉淀產(chǎn)生時間的影響，旨在為該實驗教學篩選維持反應體系穩(wěn)定性效果最佳的反應容器，為“Vc 的定量測定（磷鉬酸法）”實驗中反應容器的選擇提供指導，最終提高實驗教學效果。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料 玻璃試管（蜀玻集團），PP 試管和PS 試管（世茂實驗器材有限公司）

1.2 實驗試劑 L-抗壞血酸（阿拉丁試劑公司）；鉬酸銨、草酸、EDTA、冰乙酸、偏磷酸等試劑均為分析純等級（國藥集團試劑有限公司）；超純水（ULUPURE 純水／超純水制造系統(tǒng)）。

2 實驗方法

2.1 不同材質(zhì)試管配制標準曲線體系 取玻璃試管、PP 試管和PS 試管各6 支，分別編號0～5，在3 組試管中均按照表1 配制標準曲線反應體系。注意每一步添加試劑后迅速搖勻，所有試劑添加完畢后置于30℃水浴15 min，觀察各組在水浴過程中及水浴顯色后靜置1 h 過程中的沉淀情況，并記錄各組試管出現(xiàn)沉淀的時間。實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（Mean±SD）的形式呈現(xiàn)。

表1 標準曲線制作

2.2 不同材質(zhì)試管浸出液紫外光譜掃描 在玻璃試管、PP 試管和PS 試管中分別加入6.5 mL 超純水，封口室溫浸泡3 d 和7 d，浸泡液用0.22 μm 濾膜過濾。以鮮制超純水歸零基線，用紫外可見分光光度計（UV-6100，上海元析儀器有限公司）掃描3組浸出液在200～350 nm 波長范圍的吸收強度。

3 結果

3.1 不同材質(zhì)試管組的沉淀情況 在30℃水浴15 min 過程中，玻璃試管組未出現(xiàn)沉淀；PP 試管組和PS 試管組的0～5 號管依次產(chǎn)生沉淀，其中0 號管沉淀時間分別為（161±0.6）s 和（160±0.8）s，5 號試管沉淀時間分別為（897±5.2）s 和（857±4.7）s。Origin 2018 軟件線性擬合結果表明，PP 試管組和PS 試管組中各管的Vc 含量與沉淀時間呈線性關系（圖1），回歸方程分別為y=2.9623x+155.05（R2=0.9966）、y=2.7851x+144.52（R2=0.9972）。

圖1 不同試管組的沉淀時間

各組沉淀情況如圖2（見封四）所示，玻璃試管組在水浴和靜置的過程中保持澄清；PP 試管組和PS 試管組中各試管在水浴過程中都產(chǎn)生了沉淀，且沉淀顏色均呈現(xiàn)由黃色到墨綠色的梯度變化。靜置1 h 過程中，PP 組和PS 試管組的各試管產(chǎn)生的黃色沉淀逐漸增加，至靜置時間結束后，各管底部可觀察到明顯的沉淀積累。

圖2 不同試管組在不同時間的沉淀情況

3.2 浸出液紫外光譜掃描圖譜 各試管組浸出液紫外掃描圖譜如圖3所示，玻璃試管組3 d 和7 d浸出液在200～350 nm 范圍均無明顯紫外吸收；PP組和PS 組的3 d 浸出液在200～225 nm 處檢測到紫外吸收，7 d 浸出液在200～320 nm 范圍內(nèi)均有強度遞減的吸收，且7 d 浸出液紫外吸收強度明顯高于3 d 浸出液。同時，PP 組在不同時間浸出液的紫外吸收強度略低于PS 組，該結果與PP 試管組沉淀產(chǎn)生時間略長于PS 試管組情況相符。結果表明，PP 試管和PS 試管在室溫條件下以水為溶媒可溶出具紫外吸收的物質(zhì)，且該條件下溶出物隨時間延長而增加，持續(xù)溶出時間至少7 d。

圖3 浸出液紫外掃描圖譜

4 討論

鉬酸銨與偏磷酸在酸性條件下合成黃色磷鉬酸銨沉淀，磷鉬酸銨沉淀在鉬酸銨過量時能在過量的磷鉬酸鹽溶液中溶解［3］。各組標準曲線體系中存在過量的鉬酸銨，因此反應初期產(chǎn)生的磷鉬酸銨能溶解，即各組0 號試管中溶液應呈黃色澄清狀態(tài)。1～5 號管中存在不同含量的還原性Vc，將相應量的黃色磷鉬酸銨還原為鉬藍，因此應呈現(xiàn)黃色到墨綠色（黃色和藍色的復合）的梯度變化。

本研究結果顯示（圖2），玻璃試管組各管在30℃水浴和靜置1 h 的過程中均保持澄清狀態(tài)，且0～5 號管顏色變化如上所述；PP 試管組和PS試管組各管在水浴15 min 過程均產(chǎn)生大量黃色沉淀，且各管產(chǎn)生沉淀的時間隨Vc 含量的增加而增加。PP 試管組和PS 試管組與玻璃試管組相比僅存在反應容器差異，標準曲線反應體系的配制方法完全一致。結合PP 試管和PS 試管浸出液紫外光譜掃描結果可推斷，反應過程中PP 試管和PS 試管有促進磷鉬酸銨沉淀產(chǎn)生的物質(zhì)滲出。為初步驗證該推測，選用洗滌并浸泡不同時間的PS 和PP 試管重復配制標準曲線體系，結果顯示，洗滌后的試管沉淀產(chǎn)生時間相比于未洗滌的試管得到增加，且沉淀產(chǎn)生時間與洗滌次數(shù)呈正相關；但經(jīng)多次洗滌后，0 號管依然在30 min 內(nèi)出現(xiàn)沉淀。該結果在一定程度上驗證了上述推測，并說明該物質(zhì)不是殘留在PP 試管和PS 試管表面，而是從壁材中緩慢持續(xù)滲出，無法通過常規(guī)的洗滌操作除盡。

一次性塑料制品由于其良好的化學穩(wěn)定性、成型性和加工性，被廣泛應用于生命科學實驗室，通常在塑料加工過程中可通過輻照滅菌技術滅菌和除酶，但生產(chǎn)過程中添加的塑料助劑（例如增塑劑、抗氧化劑、潤滑劑、抗氧劑、阻燃抑煙劑等）存在溶出、滲出和遷移的情況，給科學實驗帶來無法預估的影響。G.Reid McDonald 等［4］發(fā)現(xiàn)沖洗過一次性塑料管的水、甲醇和二甲基亞砜均對人源單胺氧化酶有明顯抑制作用，對溶出物進行質(zhì)譜分析鑒定出一種抗菌劑和一種潤滑劑。在塑料制品的生產(chǎn)中通常會使用多種添加劑，在不同溫度和溶媒條件下溶出物的種類和量不同。據(jù)馬立群等［5］的報導，磷系阻燃抑煙劑在常用塑料制品中應用廣泛，包括無機系的磷酸銨鹽、多磷酸鹽和聚磷酸銨等，以及有機系的磷酸酯類，阻燃效果較佳，但易從聚烯烴壁材遷移。本研究中PP 試管和PS 試管組產(chǎn)生的大量黃色沉淀應是在硫酸、偏磷酸、草酸和乙酸存在的酸性條件下，塑料試管中的一種或多種磷系阻燃抑煙劑溶出所致。塑料試管中添加劑種類繁多，要確定其中對實驗結果有影響的溶出組分，需采用元素分析儀、液相色譜、氣相色譜聯(lián)合質(zhì)譜對溶出物進行全組分分析，所需設備昂貴，有待進一步研究。本研究表明，磷鉬酸法測Vc 含量實驗中不宜選用PP 和PS 試管作為反應容器，其中的溶出物易致反應體系產(chǎn)生沉淀；玻璃試管中反應體系能在水浴顯色后維持至少1 h 的穩(wěn)定，避免產(chǎn)生沉淀而影響比色結果，適用于該實驗教學要求。