朱美江 任成達(dá) 蔡雯婷 梁秀瑋 金惠子 張瑞玲 劉暢 范佳淇 沈天怡 于靖

老年性黃斑變性(age-related macular degeneration，AMD)是目前老年人視力受損和致盲的最主要原因之一。除年齡外，遺傳基因、吸煙史、視網(wǎng)膜慢性光損傷以及營養(yǎng)攝入不良等都是AMD相關(guān)危險因素。AMD根據(jù)病理類型分為干性AMD和濕性AMD，濕性AMD的病理變化是形成脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)[1]。目前臨床上主要通過玻璃體內(nèi)注射抗血管內(nèi)皮生長因子治療濕性AMD，雖然有一定療效，但是無法有效治愈[2]。AMD患者主要依據(jù)癥狀、眼底照相、光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)以及熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)明確診斷[3]，而干性AMD患者早期不出現(xiàn)明顯的視力下降，很難在早期診斷并進(jìn)行有效的治療，約10%的患者會進(jìn)展到濕性AMD。目前，尚沒有研究發(fā)現(xiàn)如何預(yù)防干性AMD發(fā)展成濕性AMD，因此，如何早期發(fā)現(xiàn)進(jìn)展的干性AMD，并及時阻斷疾病進(jìn)展，顯得尤為重要。

微小核糖核酸(microribonucleic acid，miRNA)是一類長度為21～25個核苷酸的非編碼核苷核酸(ribonucleicacid，RNA)[4]，通過剪輯互補(bǔ)原則結(jié)合到靶信使核糖核酸(messageribonucleicacid，mRNA)3’非翻譯區(qū)(3’untranslatedregion，3’UTR)，誘導(dǎo)mRNA降解或阻止其翻譯進(jìn)行，從而調(diào)控目的基因的表達(dá)。越來越多的研究表明，miRNA參與細(xì)胞增殖，凋亡、死亡和細(xì)胞分化等一系列生物學(xué)進(jìn)程。Karali等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA參與調(diào)控視網(wǎng)膜的發(fā)育和視網(wǎng)膜疾病的進(jìn)展[6]，并且miRNA表達(dá)異常與AMD病程相關(guān)[7]。多項研究也證明了外周循環(huán)血中miRNA對于疾病的早期診斷具有重要的作用[8-9]。本研究通過基因芯片技術(shù)檢測AMD患者外周血中miRNA表達(dá)水平與AMD病程進(jìn)展的相關(guān)性，并采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，RT-qPCR)的方法定量分析AMD患者血液中的miRNA表達(dá)水平，旨在發(fā)現(xiàn)對于早期診斷AMD具有參考價值的miRNA。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年1月至2016年11月同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院眼科門診就診的6例AMD患者作為試驗組，其中男4例，女2例，年齡(68.5±7.8)歲。AMD診斷依據(jù)為年齡>50歲，眼底散在玻璃膜疣、視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜萎縮、出血伴新生血管，經(jīng)OCT以及FFA確診[10]。同期選取6名年齡和性別與之相匹配的正常老年人為對照組，其中男4人，女2人，年齡(65.7±6.9)歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。擴(kuò)大樣本的病例對照研究中納入了126例AMD患者和140名健康受試者，AMD組男67例，女59例，年齡(58.4±11.2)歲，其中包括72例干性AMD患者及54例濕性AMD患者；健康受試組男74人，女66人，年齡(54.9±10.7)歲。兩組性別與年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)[10]：(1)眼底彩色照相有融合的邊界不清的玻璃膜疣，黃斑區(qū)視網(wǎng)膜下出血；(2)OCT表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮/脈絡(luò)膜毛細(xì)血管層的紅色反射光帶，局限性增厚；(3)FFA呈現(xiàn)透見熒光時，表現(xiàn)為視網(wǎng)膜色素上皮萎縮，色素沉著處可有遮蔽熒光，后期有熒光素滲漏。排除標(biāo)準(zhǔn)[11]：(1)高度近視，近期診斷為結(jié)膜炎、角膜炎或葡萄膜炎；(2)黃斑裂孔患者、黃斑水腫、視網(wǎng)膜血管閉塞或中心性漿液性脈絡(luò)膜視網(wǎng)膜病變；(3)近期確診的感染、高血壓、糖尿病、癌癥、阿爾茨海默病、中風(fēng)、自身免疫性疾病等器質(zhì)性病變；(4)任何未完成相關(guān)檢查或調(diào)查的患者。

1.3 方法

1.3.1 RNA提取用肝素抗凝管分別采集試驗組及對照組外周靜脈血0.5 mL，加入TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，美國)1 mL。室溫放置5 min，轉(zhuǎn)移至滅菌的2 mL離心管中，12 000 r·min-1離心5 min，棄沉淀，加入0.2 mL氯仿，混勻后室溫放置15 min。4 ℃ 12 000 r·min-1離心5 min，吸上層水相加入另一離心管，加入0.5 mL異丙醇，混勻后室溫放置5～10 min，4 ℃ 12 000 r·min-1離心10 min，RNA沉于管底，棄上清，加入1 mL體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇懸浮沉淀，4 ℃ 8000 r·min-1離心5 min，盡量棄上清，空氣干燥沉淀，溶解于20 μL DEPC水中，留樣2 μL定量，其余-70 ℃保存。使用NanodropND-2000分光光度計(Thermo Scientific，Worcester，MA，美國)測定RNA的純度。

1.3.2 基因芯片技術(shù)分析通過miRCURYTMHy3TM/Hy5TM標(biāo)記試劑盒將經(jīng)過質(zhì)量檢測的兩組全血樣本總RNA進(jìn)行靶標(biāo)制備，與miRCURYTM核苷酸芯片進(jìn)行芯片雜交。清理基因芯片后，用分析系統(tǒng)(genepix Pro 6.0軟件，Axon)分析所有芯片，選取每張芯片上修正值都≥30的非對照探針做標(biāo)準(zhǔn)化，以這部分探針中值(median，M)作為標(biāo)準(zhǔn)化因子對整張芯片的點做標(biāo)準(zhǔn)化處理，即各個miRNA修正值/M=標(biāo)準(zhǔn)值。

1.3.3 RT-PCR分析用Taqman miRNA檢測方法檢測兩組全血樣品中miRNA的表達(dá)。使用Applied Biosystem(Foster City，CA，USA)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒中的試劑、引物和探針。取12份全血總RNA(120 ng)分別加入含有逆轉(zhuǎn)錄混合物和引物的15 μL反應(yīng)體系中?；靹蚝?4 ℃孵育2 min，94 ℃進(jìn)行20 s，60 ℃進(jìn)行34 s。所有實驗均使用Mx3005P qPCR系統(tǒng)(Agilent，Santa Clara，CA，美國)進(jìn)行。用18 S RNA作內(nèi)參數(shù)據(jù)，通過比較循環(huán)閾值(2-ΔΔCT)計算miRNA的相對表達(dá)量。使用線性模型微陣列數(shù)據(jù)分析來自微陣列或轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的基因表達(dá)數(shù)據(jù)[12]。

1.3.4 生物信息學(xué)分析通過miRBase(http：//www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/Microcosm)、Miranda(http：//www.microrna.org/microrna/ home.do hg19，Miranda)和targetscan(http：//www.targetscan.org/vert_60/)等基因庫預(yù)測miRNA的目的基因。使用GO條目、“京都基因和基因組百科全書”分析繪制基因本體注釋圖，并標(biāo)注目的基因。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析使用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過雙尾測驗分析試驗組與對照組之間外周血中miRNA的表達(dá)量差異。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic，ROC)分析驗證多種miRNA(尤其是上述三種表達(dá)量明顯差異的miRNA)的診斷效果，并計算靈敏度和特異度。檢驗水準(zhǔn)：α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 miRNA表達(dá)量差異基因芯片分析結(jié)果顯示，與對照組相比，試驗組中216個外周血miRNA的表達(dá)水平存在差異，其中111個miRNA表達(dá)量上升，105個miRNA表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。由于表達(dá)量不同的miRNA數(shù)量較多，將P值設(shè)定為小于0.05，且差異倍數(shù)大于兩倍作下一步分析。在此條件下共篩選出35個差異表達(dá)的miRNA，其中15個miRNA表達(dá)量上升，20個miRNA表達(dá)量下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均為P<0.05)。見表1。

2.2 生物信息學(xué)分析GO分析了調(diào)控不同信號通路的相關(guān)靶基因，與生物過程相比，調(diào)控細(xì)胞過程、單一生物過程和代謝過程相關(guān)通路的基因表達(dá)量顯著改變，這意味著表達(dá)量異常的miRNA主要參與調(diào)控上述的生物學(xué)過程。為了明確具體通路，進(jìn)行了miRNAs靶基因的通路分析(數(shù)據(jù)庫：http：//www.kegg.jp/)。結(jié)果顯示，細(xì)胞周期通路與AMD的相關(guān)性最高，相關(guān)程度明顯高于其他相關(guān)通路。這表明細(xì)胞周期失調(diào)可能參與AMD疾病發(fā)展過程。

2.3 擴(kuò)展性病例研究結(jié)果對照試驗從微陣列測量結(jié)果中選取10個miRNA(miR-152、miR-27a-3p、miR-28-5p、miR-195-5p、miR-559、miR-25-3p、miR-29b-3p、has-let-7c、miR-328和miR-584-5p)進(jìn)行對比。與健康受試組相比，AMD組中miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p的表達(dá)明顯增加，分別增加(2.68±1.00)倍、(3.53±1.78)倍和(4.23±3.08)倍。而其他miRNA兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖1。

2.4 miRNA的表達(dá)量差異與AMD病程相關(guān)性進(jìn)一步驗證上述3種miRNA的表達(dá)量，在濕性AMD患者中miR-27a表達(dá)量比干性AMD患者中更高，而miR-29b-3p和miR-195-5p表達(dá)量兩組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均為P>0.05)。見圖2。

表1 基因芯片技術(shù)分析得出miRNA表達(dá)量差異

名稱表達(dá)水平差異倍率hsa-miR-644b-5p上升4.92hsa-miR-559上升3.71hsa-miR-152上升3.66hsa-miR-195-5p上升3.41hsa-miR-27a-3p上升2.63hsa-miR-126-5p上升2.51hsa-miR-4638-5p上升2.43hsa-miR-28-5p上升2.34hsa-let-7c上升2.33hsa-miR-5189上升2.29hsa-miR-1273f上升2.15hsa-miR-513b上升2.08hsa-miR-25-3p上升2.07hsa-miR-149-3p上升2.01hsa-miR-29b-3p上升2.00hsa-miR-513c-3p下降0.47hsv2-miR-H9-3p下降0.46hsa-miR-30c-1-3p下降0.46hsa-miR-4723-3p下降0.46hsa-miR-3614-3p下降0.45hsa-miR-3195下降0.45hsa-miR-4305下降0.45hsa-miR-328下降0.44hsa-miR-4324下降0.41hsa-miR-4658下降0.41hsa-miR-584-5p下降0.38hsa-miR-2114-5p下降0.38hsa-miR-186-3p下降0.38hsa-miR-5571-5p下降0.38hsa-miR-18b-3p下降0.36hsa-miR-4667-3p下降0.34hsa-miR-4436b-5p下降0.33hsa-miR-4653-3p下降0.31hsv1-miR-H14-3p下降0.29hsa-miR-1470下降0.13

圖1 AMD組與對照組血清中差異表達(dá)的miRNA。**P<0.01，***P<0.001

2.5 miRNA表達(dá)量差異的診斷效果用ROC進(jìn)一步分析了126例AMD患者和140名健康受試者樣本中3種miRNA表達(dá)量差異的診斷效果。通過RT-PCR方法檢測每個參與者的miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p表達(dá)水平，將數(shù)據(jù)輸入SPSS軟件，用ROC曲線表示表達(dá)量不同的miRNA的診斷效果。根據(jù)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，3種miRNA都可以作為AMD的診斷標(biāo)記物。miR-27a-3p(圖3A)、miR-29b-3p(圖3B)和miR-195-5p(圖3C)的ROC面積分別為0.925(95%CI=0.892～0.963)和0.757(95%CI=0.679～0.832)和0.766(95%CI=0.672～0.813)。該結(jié)果顯示，外周血中的miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p具有作為AMD診斷的生物標(biāo)志物的可能性。當(dāng)miR-27a-3p≥12.0時，靈敏度為0.825，特異性為0.728；當(dāng)miR-29b-3p≥10.6時，靈敏度為0.688，特異性為0.718；當(dāng)miR-195-5p≥10.2時靈敏度為0.726，特異性為0.596。

圖2 miR-27a、miR-29b-3p和miR-195-5p在干性AMD、濕性AMD與對照組中的表達(dá)

圖3 miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p診斷AMD的ROC曲線。A：miR-27a-3p的ROC曲線；B：miR-29b-3p的ROC曲線；C：miR-195-5p的ROC曲線

3 討論

AMD是50歲以上人群不可逆視力喪失最主要的原因之一。干性AMD患者早期僅出現(xiàn)輕度癥狀，但進(jìn)展為濕性AMD時，患者的視力嚴(yán)重受損。目前，針對濕性AMD主要是通過抗VEGF藥物治療，而對于干性AMD，多使用抗氧化劑延緩其癥狀發(fā)展，因此尋找AMD早期診斷和預(yù)后的有效指標(biāo)尤為重要[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-27a-3p、miR-195-5p和miR-29b-3p在AMD患者中的表達(dá)量存在明顯差異，因此，外周血中miRNA可能成為濕性AMD早期診斷的生物標(biāo)志物。本研究還彌補(bǔ)了AMD病例中外周血miRNA高通量分析的缺失，發(fā)現(xiàn)AMD患者中miRNA水平的變化情況，對于AMD生物標(biāo)志物的研究具有重要的作用。

目前已發(fā)現(xiàn)miRNA調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能并參與多種細(xì)胞通路。視網(wǎng)膜細(xì)胞功能紊亂是導(dǎo)致AMD疾病進(jìn)展的關(guān)鍵因素。近期的研究表明，miRNA，如miR-17、miR-21、miR-27、miR-132、miR-204、miR-210、miR-296、miR-378、miR-519c和miR-15/107等都與AMD的病程發(fā)展有關(guān)[14-15]。眼內(nèi)miRNA的失調(diào)可能同時導(dǎo)致血液中miRNA表達(dá)量的差異。因此，研究外周血中miRNA在AMD患者中的表達(dá)量差異對于發(fā)現(xiàn)AMD疾病的無創(chuàng)生物標(biāo)志物具有重要意義。本研究利用基因芯片技術(shù)顯示，AMD組與對照組中外周血miRNA的表達(dá)量差異，共檢測到35種變化倍率大于2的miRNA(15種miRNA表達(dá)量上調(diào)和20種miRNA表達(dá)下調(diào))，考慮到miRNA表達(dá)的個體化差異，從中選擇10個表達(dá)量水平顯著且穩(wěn)定的miRNA，其余miRNA有待進(jìn)一步驗證。生物形態(tài)學(xué)分析表明，外周血中miRNA表達(dá)量差異主要與細(xì)胞進(jìn)程，生物調(diào)控和代謝過程有關(guān)，同時表明細(xì)胞功能失調(diào)是AMD的主要發(fā)病機(jī)制。此外，靶基因的功能富集分析表明，細(xì)胞周期通路在AMD發(fā)病機(jī)制中百分比最大。通路分析的結(jié)果證實了AMD患者中的細(xì)胞功能失調(diào)。然而，目前尚無一項完整的關(guān)于AMD進(jìn)展與細(xì)胞周期功能障礙的研究。因此，本研究的結(jié)果將為AMD疾病研究進(jìn)展提供新的方向。

盡管微陣列譜具有快速、穩(wěn)定和高通量結(jié)果的優(yōu)點，但其包含的樣本容量較少。因此，我們進(jìn)行了擴(kuò)大樣本的病例對照試驗進(jìn)行驗證。從基因芯片分析結(jié)果中選出10個miRNA (miR-152、miR-27a-3p、miR-28-5p、miR-195-5p、miR-559、miR-25-3p、miR-29b-3p、has-let-7c、miR-328和miR-584-5p)用于進(jìn)一步驗證，發(fā)現(xiàn)其驗證結(jié)果與miRNA基因芯片試驗結(jié)果相一致。在10個選定的miRNA中，三個miRNA檢測到統(tǒng)計學(xué)差異。與健康受試組相比，AMD組中miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p表達(dá)量分別為2.68、3.53和4.23倍。其中miR-27a-3p在干性和濕性AMD組之間同樣表現(xiàn)出表達(dá)量水平差異，提示miR-27a-3p更具有作為AMD疾病進(jìn)展生物標(biāo)志物的潛力。3種miRNAs的ROC曲線分析也顯示這3種miRNAs可以作為AMD的生物標(biāo)志物。同時miR-27a-3p也表現(xiàn)出最高的靈敏度(0.825)和最高的特異性(0.728)。

目前尚沒有研究發(fā)現(xiàn)miR-27a-3p、miR-29b-3p和miR-195-5p在AMD的發(fā)病中發(fā)揮作用。本研究發(fā)現(xiàn)濕性AMD中miR-27a-3p的表達(dá)高于干性AMD，miR-27a-3p表達(dá)量上調(diào)可能與濕性AMD的CNV生成有關(guān)。miR-29-3p和miR-195-5p分別位于染色體18和17上，這兩種miRNA參與細(xì)胞分化和腫瘤形成[16]，在多種疾病的診斷與治療中發(fā)揮作用[17]。后續(xù)試驗將重點研究上述三種基因與AMD病程之間的關(guān)系。

本研究尚有一些不足之處。首先，樣本量較??；其次，本研究缺乏長期的隨訪資料，很難確定循環(huán)miRNA在AMD疾病發(fā)展中的預(yù)后效應(yīng)；第三，盡管本研究中發(fā)現(xiàn)了幾種具有潛在作用的特異性miRNA，但詳細(xì)的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究?？紤]到本研究的數(shù)據(jù)是基于AMD患者的全血樣本，外周血中miRNA含量的變化可能不完全符合局部變化，在進(jìn)行進(jìn)一步的體外研究之前應(yīng)進(jìn)行更多的分析。因此，在后續(xù)的研究中將擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行組織和血樣中miRNA表達(dá)量的比較，進(jìn)一步研究miRNAs在AMD發(fā)病機(jī)制中的確切作用。