李浩然 武專昌 劉會會 朱曉慧 韓旭 張冉 張國良 夏小靜 王鑫

摘? 要：鴨圓環(huán)病毒（DuCV）感染引起淋巴細(xì)胞凋亡，其ORF3蛋白是唯一具有凋亡活性的病毒蛋白，但目前ORF3特異性抗體的缺乏限制了其生物學(xué)功能的深入研究。DuCV包含基因I型和基因II型兩種基因型，利用軟件分析兩基因型ORF3同源性，選取保守性肽段進(jìn)行多肽合成，并與鑰孔血藍(lán)蛋白（KLH）偶聯(lián)，多次加強(qiáng)免疫兔子，采集血清并純化IgG后制備ORF3多克隆抗體。ELISA檢測發(fā)現(xiàn)此抗體能特異性與ORF3保守肽段反應(yīng)，并具有較高的效價，間接免疫熒光（IFA）顯示此抗體能特異性識別兩基因型ORF3蛋白，但并不能用于western blot檢測，說明此多抗主要識別ORF3空間構(gòu)象的表位?？傊覀兂晒χ苽淞颂禺愋宰R別兩種基因型DuCV ORF3蛋白的抗體，為今后深入探究DuCV ORF3蛋白的生物學(xué)功能提供了良好的研究工具。

關(guān)鍵詞：鴨圓環(huán)病毒;ORF3蛋白;多肽合成;多克隆抗體

中圖分類號：Q511? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B? ? ?文章編號：1673-1085（2019）3-0036-05

鴨圓環(huán)病毒（Duck Circovirus，DuCV）屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬，單鏈環(huán)狀DNA病毒，主要引起鴨的免疫抑制性疾病，感染的鴨子主要表現(xiàn)為羽毛凌亂、生長遲緩、體重減輕，胸腺、法氏囊、脾臟不同程度出血腫脹、淋巴細(xì)胞壞死等特征[1]。

組織病理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該病毒感染主要引起鴨法氏囊淋巴細(xì)胞減少、萎縮、組織細(xì)胞增生等[2]，原位熒光檢測也表明DuCV感染鴨后在鴨的脾臟、胸腺和法氏囊中形成明顯的病灶[3]，提示我們DuCV的致病作用可能主要與引起淋巴細(xì)胞的凋亡相關(guān)，這與PCV2的致病機(jī)理極為相似。相琪強(qiáng)等[4] （2012）發(fā)現(xiàn)DuCV基因組中除了含有編碼衣殼蛋白（Cap）和復(fù)制相關(guān)蛋白（Rep）兩個重要的ORF之外，位于ORF V1的互補(bǔ)鏈上的第三個功能閱讀框ORF3，該蛋白大小約為9.2kD，與CAV的VP3和PCV2的ORF3蛋白大小相近，且具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的能力。

目前，DuCV根據(jù)基因組序列同源性分為基因I型和基因II型兩種基因型[5]，魏宗等[6]（2011）發(fā)現(xiàn)ORF3基因在兩基因型中也存在明顯的差異，大小分別為297bp和237bp，同型之間氨基酸的同源性為88.6%～100%，而兩型之間氨基酸的同源性只有72.2%～81.0%。王鑫等[7]（2018）首次報道了ORF3蛋白的核定位信號，并闡明了兩基因型ORF3 C端差異的20個氨基酸序列在調(diào)控ORF3胞核定位與凋亡活性中的關(guān)鍵作用。為進(jìn)一步研究ORF3的生物學(xué)作用，闡明DuCV ORF3蛋白的生物學(xué)功能，本研究利用人工合成多肽法成功制備ORF3蛋白特異性的兔源多克隆抗體，并建立針對兩基因型DuCV ORF3的間接免疫熒光檢測方法，為今后深入探究DuCV的ORF3蛋白的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 試驗材料? 質(zhì)粒G2-ORF3（FJ0601株ORF3基因與GFP融合表達(dá)質(zhì)粒）、G1-ORF3（WF0701株ORF3基因與與GFP融合表達(dá)質(zhì)粒）由實驗室保存[1];抗原多肽由上海友科生物科技有限公司合成;弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購自美國Sigma公司;GFP單抗、HRP-羊抗兔IgG均購自英國Abcam公司;ECL試劑盒購自美國Thermo Scientific公司;其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2? 特異性DuCV ORF3抗原肽段的合成? 根據(jù)DuCV ORF3基因編碼的氨基酸序列，利用在線蛋白分析軟件對兩基因型DuCV ORF3蛋白共同抗原表位、親水性和抗原性進(jìn)行分析，確定抗原肽段氨基酸序列，由上海友科生物科技有限公司合成并耦聯(lián)KLH（耦聯(lián)劑為Sulfo-SMCC），合成后置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3? 多肽的溶解與保存? 重組多肽的溶解性與多肽的極性有關(guān)。人工合成的多肽溶解前先加入DMSO粉末（每1mg多肽溶于200～300μl的DMSO），然后用pH為7.8左右的PBS定容至1ml，所得多肽濃度為1mg/ml。溶解后的多肽分裝至凍存管中置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?，避免反?fù)凍融。

1.4? 多克隆抗體的制備? 將溶解后的抗原與弗氏佐劑按1：1進(jìn)行乳化，取一滴乳化后的液體滴在水面，若液體呈球形而不擴(kuò)散，則證明抗原與弗氏佐劑乳化完全。將乳化完全后的抗原按0.6mg/只對兔子進(jìn)行頸背部皮下多點(diǎn)注射，每隔2周加強(qiáng)免疫1次，首免用弗氏完全佐劑，之后用弗氏不完全佐劑，免疫5次后，頸動脈采血并分離血清，分裝保存于-80℃。

1.5? ELISA測定兔源多克隆抗體的特異性與效價? 將偶聯(lián)KLH的多肽做包被原，采用間接非競爭ELISA測定ORF3抗體的效價，在經(jīng)過4次加強(qiáng)免疫后，檢測抗體效價，進(jìn)行頸動脈采血，分離得到血清，分裝保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.6? 間接免疫熒光（IFA）檢測多抗的反應(yīng)性? ? ? ?G2-ORF3、G1-ORF3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞48h后，4%多聚甲醛進(jìn)行細(xì)胞固定，用1：500稀釋的抗ORF3多抗37℃孵育1h后，PBS清洗3次。加入1：1000稀釋的Alex Fluor594標(biāo)記的羊抗兔二抗37℃孵育1h，最后用DAPI染細(xì)胞核后封片，觀察熒光。

1.7? western blot檢測多抗的反應(yīng)性? G2-ORF3、G1-ORF3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞，樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印PVDF膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，用1：2000稀釋的抗ORF3多抗4℃孵育12h，TBST洗膜5次，15min/次。加入1：10000稀釋的HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫孵育2h，TBST洗膜5次，15min/次，用ECL發(fā)光試劑盒顯影。

2? 結(jié)果

2.1? DuCV ORF3多肽氨基酸序列分析? 利用在線蛋白分析軟件對兩基因型DuCV ORF3蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，選擇兩基因型共同的抗原表位，避免選擇蛋白內(nèi)部重復(fù)或接近重復(fù)端的序列作為抗原，以提高獲得抗體的特異性。經(jīng)過蛋白信號肽、親水性和抗原性分析，最終選擇C-IPGHERARLFLPAT-NH2作為合成多肽的序列。采用固態(tài)多相合成法合成多肽，與KLH耦聯(lián)后經(jīng)高效層析純化，并經(jīng)高效液相色譜分析鑒定后純度達(dá)到后續(xù)試驗要求?；瘜W(xué)合成多肽經(jīng)HPLC檢測其純度，結(jié)果見圖1，合成肽的多肽純度較高，雜峰少。經(jīng)計算該多肽的純度為90.01%，符合免疫純度要求。

2.2? ORF3兔源多克隆抗體ELISA效價測定? ?間接ELISA檢測兔血清抗多肽抗體OD值，采用多肽與BSA偶聯(lián)物做包被原，包被濃度為1μg/ml， 進(jìn)行間接非競爭ELSIA，陽性判斷的依據(jù)是抗體檢測OD450值/空白對照檢測OD450值>2.1。5次免疫后，KLH偶聯(lián)肽免疫兔子血清抗多肽抗體效價不低于1：80000。

2.3? ORF3兔源多克隆抗體的應(yīng)用? G2-ORF3、G1-ORF3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF-1細(xì)胞后48h，固定細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光或收集細(xì)胞進(jìn)行western blot，檢測ORF3蛋白的表達(dá)。IFA結(jié)果顯示，1：200稀釋的ORF3兔源多抗能同時與G2-ORF3、G1-ORF3蛋白反應(yīng)，和融合表達(dá)的GFP能很好的共定位（圖2）。但將制備的兔源ORF3多克隆抗體1：2000稀釋進(jìn)行western blot時，并未檢測到ORF3蛋白表達(dá)，而GFP抗體能檢測到GFP-G2-ORF3、GFP-G1-ORF3的表達(dá)（圖3）。說明制備的ORF3兔源多抗可用于兩基因型ORF3蛋白的免疫熒光檢測。

3? 討論

鴨圓環(huán)病毒能引起鴨免疫抑制性疾病，感染的鴨子會損害免疫系統(tǒng)，常伴隨鴨疫里默氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒等的感染[7-10]，并且感染鴨圓環(huán)病毒后，會顯著提高這些病原感染的幾率[8，9]，提示DuCV在鴨傳染病混合感染總扮演重要角色。然而 DuCV的致病機(jī)制、病毒蛋白功能與致病性關(guān)系尚不清楚。豬II型圓環(huán)病毒（PCV2）感染仔豬可引起淋巴結(jié)中淋巴細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制免疫系統(tǒng)功能，易造成多種病原的繼發(fā)感染和混合感染[11];雞貧血病毒（CAV）感染導(dǎo)致雞骨髓脂肪化和胸腺皮質(zhì)萎縮，骨髓造血干細(xì)胞的破壞導(dǎo)致嚴(yán)重的貧血、粒細(xì)胞和血小板減少，前T淋巴細(xì)胞凋亡可引起細(xì)胞毒性T細(xì)胞和輔助性T細(xì)胞的減少，從而使雞的免疫力降低，對其它病原的易感性增強(qiáng)[12，13]。比較CAV與PCV，說明圓環(huán)病毒誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞凋亡是引起免疫損傷和免疫抑制的重要途徑。原位熒光檢測也顯示DuCV感染鴨后在脾臟、胸腺和法氏囊中形成明顯的病灶[3]，并引起淋巴細(xì)胞壞死，說明DuCV致病作用可能主要與引起淋巴細(xì)胞的凋亡相關(guān)。

ORF3是目前已知的DuCV唯一具有誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡活性的病毒蛋白，其核漿定位對其凋亡活性具有重要調(diào)控作用，兩基因型ORF3的亞細(xì)胞定位和凋亡活性存在明顯差異。但病毒自然過程中，ORF3表達(dá)與淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系目前并不清楚，組織原位分析和DuCV反向遺傳系統(tǒng)是進(jìn)一步探究兩者作用關(guān)系的重要手段。但目前缺乏針對ORF3的特異性抗體，限制了其功能的深入研究。為此，本研究利用在線蛋白分析軟件對DuCV ORF3蛋白氨基酸序列進(jìn)行分析，人工合成氨基酸序列為C-IPGHERARLFLPAT-NH2的多肽，將多肽與載體蛋白KLH耦聯(lián)作為免疫原，經(jīng)與弗氏完全佐劑乳化后免疫新西蘭大白兔，制備了兔抗DuCV ORF3蛋白的多克隆抗體。

制備的ORF3多克隆抗體具有較高的效價和特異性，ELISA效價可達(dá)1：80000，IFA試驗中，1：200稀釋均能很好地識別轉(zhuǎn)染的DF-1細(xì)胞表達(dá)的基因I型和基因II型ORF3蛋白。但western blot無法檢測到兩基因型的ORF3蛋白，而蛋白變性后多為線性表位，進(jìn)一步說明此多抗可能主要針對的是ORF3蛋白的構(gòu)想表位。使用本實驗中制備的鴨圓環(huán)病毒ORF3蛋白的多克隆抗體進(jìn)行凋亡活性相關(guān)的研究，對進(jìn)一步闡明鴨圓環(huán)病毒的致病性提供了很好地生物學(xué)材料。

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