袁曉嫻 樂 琳 姜啟興 劉曉麗 陳琬雯 夏文水 平 原

(1. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品安全與質(zhì)量控制協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 無錫 214122；3. 蘇州豐倍生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215000)

殼寡糖(COS)是一種來源廣泛、無毒、溶解性好、具有抗菌性的多糖[1-2]，將殼寡糖應(yīng)用于食品行業(yè)中，不僅可以抑制微生物的生長，延長食品保質(zhì)期，還能夠改善食品的質(zhì)量[3-4]，但是殼寡糖的抗菌性較弱[5]，通過化學(xué)改性，將具有強(qiáng)抗菌性的物質(zhì)接入殼寡糖中，可以進(jìn)一步提高其抗菌性。有研究表明，將香葉醇[6]、曲酸[7-8]、富馬酸[4]、富馬酸單甲酯[9-10]等具有抗菌性的物質(zhì)接入殼寡糖(殼聚糖)中，均能有效提高抗菌性。

殼寡糖上有3個改性位點(diǎn)，分別為C-2位氨基[11-13]、C-3位羥基[14]、C-6羥基[15]。有研究[16]表明，因為氨基具有一對強(qiáng)親核性的孤對電子，其反應(yīng)活性較羥基的高；殼寡糖的抗菌性有可能是由于C-2氨基的存在[15]，在酸性條件下，質(zhì)子化的氨基帶有正電荷，會與微生物細(xì)胞壁上的負(fù)電荷相互作用，從而影響微生物的生長代謝[2]；另由于C-3羥基存在空間位阻，C-6羥基的反應(yīng)活性較C-3羥基高，因此本試驗選定C-6位羥基為改性位點(diǎn),保留其具有抗菌作用的氨基。2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)是GB 2760—2014允許的一種食品用香料，在水果保鮮中應(yīng)用廣泛，同時也可作為防腐劑延長食品保質(zhì)期[17]。但2,4-D的毒性殘留問題限制了其應(yīng)用范圍，對2,4-D衍生物、類似物進(jìn)行研究和篩選得到具有2,4-D生物活性的物質(zhì)，必將提高其在果蔬保鮮和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍[18]。黃麗[19]以2,4-D為囊芯，以明膠/殼寡糖/葡甘聚糖為壁材制備的復(fù)合微球具有良好的緩釋性能，該復(fù)合微球可望在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等行業(yè)得到應(yīng)用。至今并未有研究涉及將2,4-D接入殼寡糖中并測定該種新物質(zhì)的理化性質(zhì)。本研究擬將2,4-二氯苯氧乙酸與殼寡糖反應(yīng)，通過傅里葉紅外、紫外可見吸收、1H核磁共振對終產(chǎn)物進(jìn)行結(jié)構(gòu)表征，所制備的新型食品添加劑2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)，以期提高殼寡糖的抗菌性，擴(kuò)大殼寡糖在食品中的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

殼寡糖：相對分子質(zhì)量1.5 kDa，脫乙酰度90%，浙江金科藥業(yè)有限公司；

2,4-二氯苯氧乙酸：97%，阿拉丁試劑有限公司；

甲烷磺酸、氯化亞砜、氨水、N,N-二甲基甲酰胺、丙酮、乙醇等：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：江南大學(xué)食品學(xué)院生物技術(shù)中心微生物實驗室。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

水浴鍋：DK-8AXX型，上海一恒科技有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

酸度計：FE20K型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

高速冷凍離心機(jī)：3K15型，德國Sigma公司；

傅里葉變換紅外光譜儀: Nicolet NexuS470型，美國Nicolet Instrument Thermo公司；

紫外—可見分光光度計：UV-1000型，上海天美科學(xué)儀器有限公司；

全數(shù)字化核磁共振波譜儀：Brucker AV400 MHz型，德國布魯克AXS有限公司；

X-射線衍射儀：D8Advanca型，德國布魯克AXS有限公司；

熱重分析儀：TGA2型，梅特勒—托利多儀器有限公司；

恒溫振蕩器：THZ-D型，太倉市豪誠實驗儀器制造有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

隔水式培養(yǎng)箱：GHP-9080N型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)的合成路線 如圖1所示。具體操作：

圖1 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)的合成路線圖

(1) 殼寡糖氨基的保護(hù)。保護(hù)殼寡糖上反應(yīng)活性較高的氨基，以避免其參與反應(yīng)。常見的殼寡糖氨基的保護(hù)方法有：Schiff堿法[8]、鄰苯二甲酸酐保護(hù)法[20]、對甲基苯磺酸成鹽法、甲磺酸保護(hù)法[21]等。本試驗采用甲磺酸保護(hù)氨基，優(yōu)點(diǎn)是在脫保護(hù)過程中不會對酯鍵造成影響。取0.02 mol的殼寡糖，在冰浴條件下溶解在30 mL甲烷磺酸中，反應(yīng)30～60 min，使甲烷磺酸與殼寡糖的氨基形成甲烷磺酸鹽，從而防止氨基參與后續(xù)反應(yīng)。

(2) 2,4-二氯苯氧乙酸的羧基活化，以提高反應(yīng)活性。采用酰氯化的方法來活化羧基[21]。取0.02 mol的2,4-二氯苯氧乙酸于圓底燒瓶中，再加入17 mL的SOCl2，60 ℃反應(yīng)6 h，反應(yīng)過程應(yīng)注意嚴(yán)格控制干燥條件，防止水分進(jìn)入發(fā)生水解，冷卻至室溫后，旋蒸除去未反應(yīng)的SOCl2，得到的透明液體為2,4-二氯苯氧乙酰氯。

(3) 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯磺酸鹽的制備。將殼寡糖甲烷磺酸鹽逐滴加入2,4-二氯苯氧乙酰氯中，室溫下反應(yīng)4 h，-18 ℃貯藏過夜，加入過量丙酮，沉淀，11 000 r/min 離心5 min使固液分離，用丙酮洗滌上清液至無色，乙醇洗滌2次，得到產(chǎn)物2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯磺酸鹽。

(4) 氨基脫保護(hù)。將2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯磺酸鹽溶于一定量的去離子水中，用氨水調(diào)節(jié)溶液的pH至7.0，析出褐色沉淀，11 000 r/min離心5 min使固液分離，將沉淀用丙酮洗滌至上清液無色，乙醇抽提48 h以去除醇溶性雜質(zhì)，真空干燥后得最終產(chǎn)品2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯(Dcpo-O-COS)。

1.2.2 結(jié)構(gòu)表征及性質(zhì)測定

(1) 傅里葉紅外光譜：殼寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紅外光譜通過傅里葉變換紅外光譜儀測定，采用溴化鉀壓片法測定，以溴化鉀為背景，掃描范圍為4 000～500 cm-1，分辨率為4 cm-1。

(2) 紫外可見吸收光譜：殼寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紫外吸收光譜通過紫外—可見分光光度計測定，紫外分光光度計的狹縫寬度為2 nm。以去離子水為空白，測定殼寡糖及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紫外全波長光譜。

(3)1H核磁共振圖譜：樣品的1H核磁共振圖譜是由全數(shù)字化核磁共振波譜儀測定，殼寡糖的測定條件為：溫度25 ℃，溶劑為重水；2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的測定條件為：溫度60 ℃，溶劑為氘代DMSO。

(4) X射線衍射：樣品的X射線衍射圖譜的測定采用X射線衍射儀，掃描條件：X光管為陶瓷型，Cu靶，射線波長為0.154 nm，光管功率為2.2 kW，X射線發(fā)生器輸出功率300 W，管壓40 kV，電流50 mA，掃描溫度25 ℃，掃描速度2°/min，掃描范圍5°～60°。

(5) 熱穩(wěn)定性：由熱分析儀器測定。檢測條件為：N2流速20 mL/min，升溫速率為20 ℃/min，加熱溫度范圍為30～450 ℃。

(6) 抑菌性：菌種活化：挑取單一菌落于LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h，吸取200 μL一代菌液于新的10 mL LB液體培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至OD600=0.5。菌液制備：將二代菌液進(jìn)行梯度稀釋，進(jìn)行預(yù)試驗選定稀釋倍數(shù)。抑菌樣品：以去離子水為溶劑，配置濃度為2.0 mg/mL的樣品(殼寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯)溶液。抑菌性測定：以滅菌后的去離子水為空白，測定殼寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸及2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的抗菌性。吸取1.0 mL的抑菌樣品及100 μL菌液至平板中，倒入40 ℃左右的瓊脂培養(yǎng)基，混合均勻，冷卻至凝固后，于隔水式培養(yǎng)箱中，37 ℃倒置培養(yǎng)24～48 h，觀察平板中細(xì)菌的生長狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 傅里葉紅外光譜分析

如圖2所示，殼寡糖的紅外光譜中，3 400 cm-1附近的寬峰屬于氨基及羥基；1 618，1 515，1 379 cm-1分別為殼寡糖的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ吸收峰；1 069 cm-1為殼寡糖糖環(huán)骨架氧橋的伸縮振動[22-23]。2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的紅外光譜中，出現(xiàn)了1 752，1 287，869，803 cm-1等新峰，其中1 752，1 287 cm-1為酯鍵的C═O吸收峰及C—O吸收峰；869，803 cm-1為苯環(huán)在1,2,4位有取代時的吸收峰；從紅外可以初步判斷目標(biāo)產(chǎn)物的合成。

圖2 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的紅外光譜圖

2.2 紫外可見吸收光譜分析

如圖3所示，紫外光譜主要用于提供分子的芳香結(jié)構(gòu)和共軛體系信息。殼寡糖本身并沒有生色團(tuán)，但殘留乙酰氨基中的C═O會顯示出吸收峰[24]。在殼寡糖的紫外光譜中，于190，280 nm左右有吸收峰。其中，190 nm 左右的吸收峰為殼寡糖氨基上的電子n→δ*躍遷的紫外吸收峰，而280 nm左右的吸收峰為C═O的R帶吸收峰[25]18-19。在終產(chǎn)物Dcpo-O-COS的紫外吸收中，229 nm處屬于芳香族化合物的B吸收帶的吸收峰，200，283 nm處的吸收峰可歸屬為羰基結(jié)構(gòu)的π→π*和n→δ*躍遷，此結(jié)果與紅外結(jié)果一致，說明2,4-二氯苯氧乙酸成功接入殼寡糖。

圖3 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的紫外—可見吸收光譜

2.3 1H核磁共振圖譜分析

由圖4可知δ=2.07處的吸收峰屬于殼寡糖中未脫盡的乙?；稀狢H3的化學(xué)位移；δ=3.11處的吸收峰屬于氨基葡萄糖殘基上H的化學(xué)位移[26]；δ=3.37～4.05為殼寡糖的特征組峰，屬于殼寡糖糖環(huán)上的氨基葡萄糖H和N-乙酰氨基葡萄糖殘基上H的化學(xué)位移[27]；δ=4.70 處的吸收峰為溶劑峰。在2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的1H核磁圖譜中，δ=2.49處的吸收峰屬于溶劑峰；δ=4.95處的吸收峰屬于與羰基相連的—CH2上氫的吸收峰；δ=6.88～7.62 處屬于苯環(huán)上未被取代H的化學(xué)位移；核磁結(jié)果與紅外結(jié)果一致，表明2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的成功合成。

圖4 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的1H核磁共振圖譜

2.4 X射線衍射圖譜分析

由圖5可知，殼寡糖有2個主要的衍射吸收峰，在2θ=13°和2θ=22°處，分別歸屬于殼寡糖分子的Ⅰ型和Ⅱ型晶型的特征吸收峰，X-射線衍射強(qiáng)度不大，說明結(jié)晶性能不強(qiáng)[25]21-22。經(jīng)改性后的2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯出峰位置稍向左偏移，且峰強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，說明將2,4-二氯苯氧乙酸引入殼寡糖之后，改變了殼寡糖內(nèi)部的結(jié)構(gòu)，使其結(jié)構(gòu)更加規(guī)整有序，結(jié)晶性能變強(qiáng)[28]。

圖5 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的X-射線衍射圖

2.5 熱穩(wěn)定性

圖6(a)為熱失重率曲線圖(TG)，圖6(b)為熱失重率曲線圖的一階導(dǎo)數(shù)曲線圖(DTG)。由圖6可知，殼寡糖在30～450 ℃時存在2個失重階段。一階失重發(fā)生于70～150 ℃，失重率為7.5%，這一階段的失重主要是由于分子中自由水和結(jié)晶水的蒸發(fā)導(dǎo)致；二階失重發(fā)生于170～350 ℃，失重率為53.5%，最快降解速率的溫度Tmax=224 ℃，這一階段的熱失重相對比較復(fù)雜，包含糖環(huán)類的脫水、解聚和烷基化單元的聚合物的分解等[25]22-23。

圖6 2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯及殼寡糖的熱重分析圖

改性后的2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯在30～450 ℃時也存在2個失重階段。其中一階失重在60～132 ℃，失重率為4.4%；二階失重在134～408 ℃，失重率為62.1%，最快降解速率的溫度Tmax=279 ℃。由此可見，2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的熱穩(wěn)定性較殼寡糖有所提高，可能是引入2,4-二氯苯氧乙酸乙酸后，使衍生物較殼寡糖的結(jié)構(gòu)和構(gòu)象更為規(guī)整有序，從而使得2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的熱穩(wěn)定性提高。此結(jié)果與上述X射線衍射分析結(jié)果一致。

2.6 抑菌性

由表1可知，殼寡糖、2,4-二氯苯氧乙酸、2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌均表現(xiàn)出抗菌性，其中2,4-二氯苯氧乙酸>2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯>殼寡糖。2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌性較殼寡糖均有所提高，可能是保留了殼寡糖具有抗菌作用的氨基，同時引入具有強(qiáng)抗菌作用的2,4-二氯苯氧乙酸。通過計算平均菌落總數(shù)可以得出，相對于殼寡糖，2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯對大腸桿菌的抗菌性提高了54.72%，對金黃色葡萄球菌的抗菌性提高了60.98%。

表1 樣品對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用

3 結(jié)論

本試驗提供了一種潛在的新型食品抗菌劑——2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯的合成路線，經(jīng)過紅外、紫外以及1H NMR對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，證明2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯合成成功，其結(jié)晶性、熱穩(wěn)定性及抗菌性較殼寡糖均有所提高，與對大腸桿菌抗菌作用相比，對金黃色葡萄球的抗菌作用提高得更為顯著，2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯有望成為一種新型抗菌劑應(yīng)用于食品行業(yè)中。

本研究中主要就新型物質(zhì)的合成和表征進(jìn)行了研究，但2,4-二氯苯氧乙酸殼寡糖酯針對細(xì)菌的抑制機(jī)理還未知，新型物質(zhì)是否能夠應(yīng)用于食品中還需要進(jìn)行相關(guān)的毒理性試驗研究。