施高翔 姜晶晶 汪云霞 趙婷 邵菁 汪天明 汪長中,3

(1.安徽中醫(yī)藥大學 中西醫(yī)結合學院；2.安徽省中醫(yī)藥科學院 中西醫(yī)結合研究所；3.中藥復方安徽省重點實驗室，合肥 230012)

白念珠菌(Candidaalbicans，C.albicans)是常見的機會致病性真菌，常引起皮膚黏膜感染[1]。文獻報道，近75%的女性一生中至少感染1次念珠菌，引起外陰陰道念珠菌病(vulvovaginalcandidiasis，VVC)[2-3]。目前，臨床用于治療VVC的抗真菌制劑種類有限，且表現出一定的毒副作用和耐藥性[4-5]，使其在臨床上的應用受到限制。

我國中藥資源豐富，來源廣泛。中藥抗真菌感染的記載由來已久，目前從中藥中篩選抗真菌藥物并研究其作用機制已成為抗真菌藥物研發(fā)領域的重要方向。通過大量文獻調研并結合課題組近幾年的藥物篩選發(fā)現，苦參(SophoraflavescensAit.)、蛇床子(Cnidiummonnieri(L.) Cuss.)兩味中藥單用無顯著抗真菌作用，但兩者在臨床上經常以藥對形式在抗VVC的復方中配伍使用，兩藥在此類復方中使用頻率排在前2位[6-7]。課題組前期實驗表明，苦參與蛇床子兩味藥按1∶1比例所得水提物具有顯著的抗真菌作用。本文著重考察苦參-蛇床子1∶1藥對水提物(Extract ofSophoraeFlavescentisRadix—CnidiiFructuscouplet medicines，ESCC)對引發(fā)VVC的白念珠菌主要毒力因子即酵母-菌絲二相轉換與生物膜形成的影響，為進一步探尋苦參-蛇床子藥對抗真菌的機制研究奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株 白念珠菌標準菌株C.albicansSC5314由第二軍醫(yī)大學姜遠英教授惠贈；白念珠菌VVC臨床株由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院皮膚性病科分離。

培養(yǎng)基和試劑 RPMI-1640培養(yǎng)基(life technologies公司)；沙氏固體、液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術有限公司)；超純水(18.2Ω Milli-Q Gradient A10超純水系統(tǒng))；YPD培養(yǎng)基(青島海博生物技術有限公司)；二甲基亞砜(Dimethyl Sulphoxide，國藥集團)；戊二醛(國藥集團)；PBS緩沖液(pH 7.0±2.0，實驗室配制)；無水乙醇(天津市永大化學試劑有限公司)，石油醚(天津市華東試劑廠)，乙酸乙酯(江蘇省強盛功能化學股份有限公司)，正丁醇(上海蘇懿化學試劑有限公司)，XTT[2,3-Bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl) -2H-tetrazolium-5-carboxanilide][生工生物工程(上海)股份有限公司]。

儀器 聚苯乙烯96孔和6孔微量培養(yǎng)板(Corning公司，美國)；酶標儀(Thermo Fisher Labserv K3)；倒置熒光顯微鏡(Olympus IX81，日本)；恒溫培養(yǎng)箱(博迅實業(yè)公司，上海)；DSX-280B 型手提式壓力蒸汽滅菌器(申安醫(yī)療器械廠，上海)；流式細胞儀(Flow Cytometer，BD Accuri C6)。

藥物 苦參、蛇床子購于安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房，并經方成武教授鑒定；氟康唑(Fluconazole，FLZ，博美生物科技)。

1.2 方法

苦參-蛇床子藥對水提取物的制備 按照1∶1比例稱取苦參和蛇床子單味藥各20 g，加入10倍量蒸餾水浸泡過夜。接冷凝回流裝置，加熱套煮沸并保持沸騰2 h，回收提取液。重復以上操作3次并混合提取液，旋轉蒸發(fā)濃縮至100mL，真空冷凍干燥成固體粉末得苦參-蛇床子1∶1藥對水提取物(Extract ofSophoraeFlavescentisRadix—CnidiiFructusCouplet medicines，ESCC)，EP管封裝低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

白念珠菌懸液的制備 在超凈工作臺中，使用接種環(huán)挑取YPD平板上白念珠菌單菌落，移種至沙氏液體培養(yǎng)基中進行活化，37℃恒溫箱中活化18～20 h，連續(xù)活化2次。以RPMI-1640培養(yǎng)基將菌液濃度調整成2×106CFU/mL和2×103CFU/mL備用。

酶標儀檢測白念珠菌的MIC80利用微量液基稀釋法[8]檢測ESCC對白念珠菌VVC臨床株的MIC80。實驗稱取ESCC凍干粉，用RPMI-1640配制終濃度為2048、1024、512、256、128、64、32、16、8、4 μg/mL的提取物藥液。將不同濃度的ESCC藥液和菌液(2×103CFU/mL)各100 μL加入96孔微量培養(yǎng)板，另設陽性對照組(2 μg/mL FLZ +菌液)和空白對照(不含任何藥液)。37℃恒溫箱中孵育24h。用多功能酶標儀于600nm波長處檢測吸光度(optical density，OD)值。相比于空白組，以吸光度減少為空白組80%的藥物稀釋度為MIC80。

XTT法檢測白念珠菌細胞的增殖活性 實驗采用XTT法考察ESCC對白念珠菌VVC臨床株細胞增殖活性的影響[9]。實驗將ESCC干粉以RPMI-1640配制終濃度為8～4096 μg/mL。將不同濃度ESCC藥液和菌液(2×106CFU/mL)各100 μL加入96孔微量培養(yǎng)板，另設陽性對照組(32 μg/mL FLZ +菌液)和空白對照組(不含任何藥液)，37℃恒溫箱中孵育24 h。

配制XTT溶液并濾過除菌，臨用前加入維生素K3(2 μmol/L)配制成XTT-VK3。96孔板每孔加入50 μL XTT-VK3，37℃恒溫箱繼續(xù)避光孵育2 h，以多功能酶標儀于492 nm波長處檢測OD值。

正斷層是常見的斷層形式，指斷層上盤在重力或水平張力作用下沿著斷層面向下運動。當周圍土質硬度較低，管子在正斷層斜拉作用下易發(fā)生拉伸破壞。該項研究利用ADINA有限元軟件模擬管子在正斷層位移錯動及管道內壓共同作用下的破壞變形，以此來研究不同內壓對輸液管道抗震性能的影響。

倒置顯微鏡觀察白念珠菌酵母-菌絲二相轉換 配制不同濃度ESCC(256、512、1024 μg/mL)與白念珠菌VVC臨床株菌懸液(2×106CFU/mL)各3 mL加入12孔板，另設陽性對照組(32 μg/mL FLZ+菌液)和空白對照組(不含任何藥液)，37℃恒溫培養(yǎng)4、8、12 h，置于倒置顯微鏡下觀察白念珠菌VVC臨床株酵母相和菌絲相生長情況，并拍照。

掃描電子顯微鏡(Scanning Electron Microscopy，SEM)觀察白念珠菌生物膜的形態(tài)結構 將蓋玻片(75%酒精過夜預處理)放入 6 孔培養(yǎng)板中，加入不同濃度ESCC(256、512、1024 μg/mL)，與白念珠菌VVC臨床株菌懸液(2×106CFU/mL)共孵育，設陽性對照組(32 μg/mL FLZ+菌液)和空白對照組(不含任何藥液)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h后以無菌 PBS 緩沖液輕洗玻片上未黏附菌體，放入預冷的2.5%戊二醛固定2 h，以30%、50%、70%、90%和無水乙醇逐級脫水各20 min，室溫干燥后，經HVS-GB 型真空蒸鍍儀噴金，掃描電鏡觀察并拍照[10]。

微孔板觀察白念珠菌成熟生物膜的生長 取玻片至于75%乙醇溶液中浸泡24 h，取出后用無菌PBS洗凈置于6孔板中，將RPMI-1640培養(yǎng)基與同體積白念珠菌VVC臨床株菌液(濃度為2×106CFU/mL)依次加入6孔微量培養(yǎng)板中混合，放入37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，待白念珠菌生物膜形成后加藥干預。實驗分別設空白對照組(不含任何藥液)、陰性對照組(只含RPMI-1640培養(yǎng)基)，陽性對照組(1024 μg/mL FLZ)、不同濃度ESCC干預組(2048、1024、512 μg/mL)，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察ESCC對白念珠菌VVC臨床株成熟生物膜的影響。

qRT-PCR 檢測白念珠菌菌絲、生物膜相關基因轉錄水平 苦參-蛇床子1∶1藥對水提物(256、512、1024 μg/mL)干預白念珠菌VVC臨床株后，5000 r/min離心5 min收集菌體，參照Mag Extractor-RNA試劑盒說明書提取總RNA。依逆轉錄試劑盒說明書，將提取的總RNA反轉錄成cDNA。采用qRT-PCR儀進行擴增，按 SYBR Green Realtime PCR Master Mix試劑盒，預變性(95℃/60 s)后，設置反應條件為：變性(95℃/15 s)→退火(55℃/15 s)→延伸(72℃/45 s)，40循環(huán)。基因轉錄水平用倍數變化(Relative Fold Change)來表示(2-ΔΔCt法)[11]。

據NCBI基因庫查得基因序列，并用Primer Premier 5.0軟件設計引物，委托上海生工生物工程有限公司合成引物(見表1)。

1.3 數據分析

2 結 果

2.1 苦參-蛇床子藥對水提物對白念珠菌的MIC80

通過檢測苦參-蛇床子藥對水提物對白念珠菌浮游菌的的最低抑菌濃度(MIC)，ESCC抗VVC臨床耐藥白念珠菌效果顯著，介于512～1024 μg/mL之間(見表2)。

2.2 苦參-蛇床子藥對水提物可影響白念珠菌細胞的增殖活性

表1 菌絲和生物膜相關基因引物序列表

表2 ESCC對白念珠菌的MIC80(μg/mL)

圖1XTT法檢測ESCC對白念珠菌代謝活性的影響(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.1The effect of ESCC on the metabolic activityC.albicans(*P<0.05，**P<0.01)

2.3 苦參-蛇床子藥對水提物可影響白念珠菌酵母-菌絲二相性轉換

實驗將ESCC和白念珠菌VVC臨床株共培養(yǎng)4h、8h、12h后，通過倒置顯微鏡觀察發(fā)現，空白對照組有菌絲相和酵母相交織形成的生物膜。而加藥組，隨著ESCC濃度的增加，菌絲形成較少，菌體數量也逐漸減少。其中當ESCC濃度為1024μg/mL時菌體數量明顯減少，且只見有酵母相菌體，幾乎無菌絲形成(見圖2)。

2.4 苦參-蛇床子藥對水提物可影響白念珠菌生物膜的形態(tài)結構

通過SEM觀察發(fā)現，空白組白念珠菌VVC臨床株酵母-菌絲相互交織，包裹著細胞外基質，形成三維立體的生物膜結構，但經不同濃度ESCC干預后，酵母相和菌絲相均不同程度減少，其中1024 μg/mL水提物組可抑制白念珠菌生物膜的形成(見圖3)。

2.5 苦參-蛇床子藥對水提物可破壞白念珠菌成熟生物膜的完整性

實驗將ESCC加入預先培養(yǎng)成熟的白念珠菌VVC臨床株生物膜中，觀察其對白念珠菌成熟生物膜的影響。結果如圖4顯示，空白對照組(圖4A/a)中白念珠菌形成致密的生物膜，而加入ESCC干預24h后(圖4D/d、E/e、F/f)，抑制了白念珠菌生物膜的形成，且隨藥對提取物濃度的增加，白念珠菌成熟生物膜的完整性受到嚴重破壞。

2.6 苦參-蛇床子藥對水提物可影響白念珠菌菌絲和生物膜相關基因轉錄水平

通過qRT-PCR檢測，結果發(fā)現相比于內參基因，白念珠菌VVC臨床株經ESCC(256、512、1024 μg/mL)干預后，可降低菌絲和生物膜形成相關基因的轉錄水平。其中1024 μg/mL藥對水提物影響最為明顯，分別使ALS1、ALS3、HWP1下調78.12%、85.73%、84.92%(見圖5)。

3 討 論

由白念珠菌引起的外陰陰道念珠菌病是困擾女性的常見病，影響女性的身體健康和生活質量[12]。而臨床常見治療藥物如氟康唑、酮康唑等的廣泛使用甚至濫用，已致出現大量白念珠菌耐藥菌株[13]，極大限制了VVC的治療。

近些年，中醫(yī)藥治療VVC越發(fā)受到學者們的關注。藥對是方劑中最小的配伍形式，是中醫(yī)藥學家在遣方用藥中的經驗凝練，體現中藥方劑的規(guī)律特征與辯證施治的內涵[14-15]。中醫(yī)認為VVC多是由濕、熱、蟲三邪所致[16]。臨床常用復方苦參洗劑和苦參蛇床子栓劑等均是以苦參、蛇床子等為主要藥物，用于治療VVC，發(fā)揮清熱燥濕、殺蟲利尿、瀉火解毒等功效[17-19]。文獻報道[20-22]苦參有效成分(苦參堿和氧化苦參堿)與蛇床子提取物單用時抗白念珠菌效果較差，二者聯用即可大大增加抗菌效應，且對陰道炎治療效果顯著。

實驗通過微量液基稀釋法檢測發(fā)現苦參-蛇床子1∶1藥對水提物(ESCC)具有一定的抗真菌效果，XTT實驗結果也表明，藥對水提物可劑量依賴性的降低白念珠菌VVC臨床株細胞的增殖活性。

圖2倒置顯微鏡觀察ESCC對白念珠菌酵母-菌絲二相性轉換的影響(×400)圖3ESCC對白念珠菌生物膜形態(tài)結構的影響(1500×).A.空白對照組；B.陽性對照組(32 μg/mL FLZ)；C.1024 μg/mL ESCC組；D.512 μg/mL ESCC組;E.256 μg/mL ESCC組圖4ESCC對白念珠菌成熟生物膜的影響(200×).A(a).2048μg/mL ESCC組；B(b). 1024 μg/mL ESCC組；C(c). 512 μg/mL ESCC組；D(d). RPMI-1640培養(yǎng)基組；E(e). 空白對照組；F(f). 陽性對照組(FLZ:1024 μg/mL)

Fig.2Effects of ESCC on yeast-hypha conversion ofC.albicans(×400)Fig.3The effect of ESCC on the morphology ofC.albicansbiofilms(1500×).A.Control;B.positive control group (32 μg/mL FLZ);C.1024 μg/mL ESCC;D.512 μg/mL ESCC;E.256 μg/mL ESCCFig.4The effect of ESCC onC.albicansmature biofilms(200×).A(a).2048μg/mL ESCC; B(b). 1024 μg/mL ESCC; C(c). 512 μg/mL ESCC; D(d). RPMI-1640 medium; E(e). Control; F(f). positive control group(FLZ:1024 μg/mL)

圖5ESCC對白念珠菌菌絲、生物膜相關基因轉錄水平的影響(*P<0.05，**P<0.01)

Fig.5Effects of ESCC on the expression ofC.albicanshypha and biofilms-related genes(*P<0.05,**P<0.01)

在實驗觀察中發(fā)現ESCC在早期對白念珠菌VVC臨床株的抑制作用顯著，而白念珠菌生長周期的早期正是酵母-菌絲二相型轉換的重要階段[23]。本實驗設計觀察4 h、8 h、12 h三個時間段，ESCC對白念珠菌的抑制作用。倒置顯微鏡觀察結果顯示，白念珠菌在4～12 h為菌絲生長期，空白組可見大量菌絲，但藥對水提物不同濃度組可顯著抑制菌絲的形成，提示ESCC的抗真菌作用可能是與抑制白念珠菌的主要毒力因子即酵母-菌絲二相轉換有關。

菌絲的形成，一方面可大大增強菌體的黏附性[23]，另一方面也是白念珠菌生物膜的形成重要組成部分[24]。生物膜是由白念珠菌生長過程中分泌到菌體外的細胞外基質包裹酵母相和菌絲相形成的致密的三維立體結構，可明顯增強白念珠菌的毒力和致病性。掃描電子顯微鏡實驗結果表明，空白組形成酵母與菌絲交織的致密的生物膜結構，但經ESCC干預后，生物膜結構不典型，菌體數量顯著減少，且菌絲形成較少。提示ESCC可影響白念珠菌的生物膜的形成。

實驗還設計觀察了ESCC對白念珠菌成熟生物膜的影響。實驗通過預先在玻片上培養(yǎng)成熟的生物膜，加藥物干預后結果發(fā)現，相比于空白組的致密生物膜結構，不同濃度加藥組均可破壞成熟生物膜的完整性，導致生物膜松散，從玻片上脫落。

目前認為，ALS1、ALS3、HWP1編碼產物與菌絲及生物膜形成密切相關，被敲除或抑制將導致酵母-菌絲形態(tài)轉化受抑制，毒力隨之下降[25-27]。為了從基因水平找尋ESCC抗真菌機理，實驗通過qRT-PCR檢測白念珠菌VVC臨床株的菌絲、生物膜形成相關基因的轉錄水平。本實驗結果發(fā)現經ESCC干預后，ALS1、ALS3、HWP1基因轉錄水平均有明顯下調趨勢，提示ESCC可影響菌絲、生物膜形成相關基因的表達，降低其轉錄水平和編碼產物。

綜上，苦參-蛇床子1∶1藥對水提物的抗真菌活性可能是通過影響白念珠菌菌絲及生物膜形成相關基因，進而使其編碼的相關產物降低，影響酵母-菌絲二相轉化，以及生物膜的形成，從而起到抗白念珠菌作用。