陳云雨，牛夏憶，李淼，李霓，劉曉平

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大腸桿菌FtsZ蛋白原核表達(dá)及多克隆抗體的制備與鑒定

陳云雨1，牛夏憶1，李淼1，李霓2，劉曉平1

1 皖南醫(yī)學(xué)院 藥物篩選與評(píng)價(jià)研究所，安徽 蕪湖 241002 2 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院-北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥物研究所 天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

為制備特異性抗大腸桿菌絲狀熱敏蛋白Z (filamentous thermosensitive protein Z，Ec-FtsZ)多克隆抗體，將基因進(jìn)行化學(xué)合成后連接pET-22b(+) 表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒Ec-FtsZ-pET-22b(+)。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌.BL21(DE3) 中進(jìn)行Ec-FtsZ原核表達(dá)與表達(dá)條件優(yōu)化，以HisTrap層析柱進(jìn)行Ec-FtsZ的分離純化，再以孔雀綠法進(jìn)行Ec-FtsZ GTPase (Guanosine triphosphatase) 活性測(cè)定。使用純化的Ec-FtsZ為抗原免疫大鼠制備多克隆抗體，經(jīng)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定實(shí)驗(yàn) (Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)、Western blotting實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)鑒定，抗Ec-FtsZ多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶256 000且具有良好的抗原特異性?？笶c-FtsZ多克隆抗體的成功制備為Ec-FtsZ生物學(xué)功能研究和生化檢測(cè)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

大腸桿菌FtsZ蛋白，原核表達(dá)，孔雀綠法，免疫熒光，多克隆抗體

大腸桿菌細(xì)胞骨架蛋白FtsZ (filamentous thermosensitive protein Z，Ec-FtsZ) 是細(xì)菌細(xì)胞分裂所必需的調(diào)控蛋白，其生物學(xué)功能與微管蛋白極其相似，被認(rèn)為是微管蛋白的同源蛋白[1-2]。Ec-FtsZ具有GTPase (Guanosine triphosphatase) 活性，在GTP存在條件下，Ec-FtsZ可在細(xì)菌內(nèi)膜中心聚集形成多聚體，進(jìn)而形成可收縮的Z環(huán) (Z ring)。Z環(huán)形成后，其他分裂調(diào)控蛋白陸續(xù)結(jié)合到Z環(huán)骨架上形成分裂體。分裂體通過提供細(xì)菌細(xì)胞縊縮力和酶活力使Z環(huán)縮小以形成隔膜，完成細(xì)菌細(xì)胞的二分裂過程[3-7]。由于FtsZ在大多數(shù)致病菌細(xì)胞分裂過程中發(fā)揮高度保守的調(diào)控作用，細(xì)菌的FtsZ與真核生物微管蛋白結(jié)構(gòu)差異較大且不易突變，其已成為抗感染藥物開發(fā)的理想靶標(biāo)之一[4,7-8]。因此，深入研究Ec-FtsZ在大腸桿菌Z環(huán)形成和定位中的調(diào)控功能對(duì)新型抗耐藥菌藥物研發(fā)具有重要意義。

Ec-FtsZ雖是組成細(xì)菌分裂體的核心蛋白，但目前對(duì)Ec-FtsZ如何調(diào)控其他分裂調(diào)控蛋白募集到Z環(huán)形成細(xì)菌分裂體的調(diào)控機(jī)制研究還不甚深入，尤其是Z環(huán)在細(xì)菌內(nèi)膜精準(zhǔn)定位的分子機(jī)制尚未明確。為了進(jìn)一步探討Ec-FtsZ上述生物學(xué)功能，本研究利用DNA重組技術(shù)原核表達(dá)和分離純化了高活性的Ec-FtsZ，并制備了高效價(jià)和特異性的大鼠抗Ec-FtsZ多克隆抗體 (Polyclonal antibody，PcAb)，為Ec-FtsZ生物學(xué)功能研究和生化檢測(cè)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-22b(+) 質(zhì)粒由北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系鄭積敏教授惠贈(zèng)；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞.Rosetta(DE3)、.BL21(DE3)、.BL21(DE3) pLysS、Ⅰ、Ⅰ、Trans 2K?DNA Marker和ProteinRuler?Ⅱ購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；酵母粉、瓊脂粉、胰蛋白胨購自O(shè)xoid公司；二辛可寧酸 (Bicinchoninic acid，BCA) 蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自Thermo公司；異丙基硫代半乳糖苷 (Isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)、GTP (Guanosine triphosphate)、氨芐西林、Freund完全佐劑和Freund不完全佐劑購自Sigma公司；小鼠抗組氨酸 (Histidine，His) 標(biāo)簽單克隆抗體、辣根過氧化物酶 (Horseradish peroxidase，HRP) 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG、HRP-山羊抗大鼠IgG、異硫氰酸熒光素 (Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC) 標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG購自Boster公司；TanonTM化學(xué)發(fā)光液購自上海天能科技有限公司；牛血清白蛋白 (Bovine serum albumin，BSA)、四甲基聯(lián)苯胺 (3,3?,5,5?-Tetramethylbenzidine，TMB) 溶液購自北京索萊寶科技有限公司；半底96孔透明板、96孔酶標(biāo)板購自Corning公司；HisTrap層析柱購自GE公司；BIOMOL?GREEN購自Enzo Biochem公司；Wistar大鼠購自維通利華公司；其他生化試劑為國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 方法

1.2.1 Ec-FtsZ原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

在NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索大腸桿菌全長基因序列 (GenBank登錄號(hào)：CP023258.1)，在該基因序列兩端分別設(shè)計(jì)Ⅰ和Ⅰ酶切位點(diǎn)后進(jìn)行全基因合成。將合成的基因片段插入pET-22b(+)表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒Ec-FtsZ-pET-22b(+)，以雙酶切法進(jìn)行鑒定?；蚱魏铣珊蜏y(cè)序由General Biosystems公司完成。

1.2.2 Ec-FtsZ原核表達(dá)

將重組質(zhì)粒Ec-FtsZ-pET-22b(+)轉(zhuǎn)化到.BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，涂布于LB固體培養(yǎng)基 (含100 μg/mL氨芐西林)，37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機(jī)挑取6個(gè)單菌落接種至含有100 μg/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基中，以1 mmol/L IPTG為誘導(dǎo)劑，30 ℃誘導(dǎo)10 h，誘導(dǎo)Ec-FtsZ表達(dá)。以10% SDS-PAGE檢測(cè)Ec-FtsZ原核表達(dá)情況。

1.2.3 Ec-FtsZ最適誘導(dǎo)時(shí)間的確定

將上述工程菌接種至含有100 μg/mL氨芐西林的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)至菌體600=0.8時(shí)，加入1.0 mmol/L IPTG，誘導(dǎo)溫度分別設(shè)置為30 ℃、25 ℃和20 ℃誘導(dǎo)Ec-FtsZ表達(dá)，在2、4、6、8、10和12 h時(shí)間點(diǎn)等量收集菌體，以10% SDS-PAGE檢測(cè)Ec-FtsZ表達(dá)情況，利用Clinx Image Analysis軟件分析Ec-FtsZ表達(dá)量。

1.2.4 Ec-FtsZ最適誘導(dǎo)溫度的確定

等量收集20 ℃、25 ℃和30 ℃條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)6 h的菌體，收集的菌體用TBS (50 mmmol/L Tris、150 mmol/L NaCl，pH8.0) 溶液重懸，以超聲波破碎菌體，離心收集裂解后的上清液和沉淀，以10% SDS-PAGE檢測(cè)Ec-FtsZ的可溶性表達(dá)情況。

1.2.5 Ec-FtsZ最適IPTG誘導(dǎo)濃度的確定

工程菌于37 ℃培養(yǎng)至600=0.8時(shí)，加入不同濃度的IPTG分別于25 ℃誘導(dǎo)6 h，IPTG濃度設(shè)置為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mmol/L。等量收集菌體，以10% SDS-PAGE檢測(cè)不同IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)Ec-FtsZ表達(dá)的影響。

1.2.6 Ec-FtsZ分離純化與鑒定

誘導(dǎo)后的工程菌經(jīng)超聲波破碎后取上清液，以25%飽和硫酸銨溶液沉淀制備粗提液。按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行Ec-FtsZ的分離純化[4]。純化的Ec-FtsZ以TBS溶液透析，再以BCA法測(cè)定蛋白濃度。

純化的Ec-FtsZ經(jīng)10% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，一抗為小鼠抗His標(biāo)簽單抗 (1∶2 000)，二抗為HRP-羊抗小鼠IgG (1∶4 000)，以TanonTM化學(xué)發(fā)光液成像。

1.2.7 Ec-FtsZ GTPase活性測(cè)定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[4,9-10]，首先將0.1 mol/L GTP溶液以反應(yīng)液 (50 mmol/L Tris、5 mmol/L MgCl2，pH 8.0) 進(jìn)行2倍倍比稀釋，共制備7個(gè)濃度梯度樣品 (2–0.031 mmol/L)。上述GTP稀釋液以25 μL/孔依次加入到含10 μmol/L Ec-FtsZ (25 μL/孔) 的半底96孔透明板中，每個(gè)濃度設(shè)置3組復(fù)孔，室溫孵育20 min。依次加入孔雀綠試劑 (50 μL/孔)，室溫反應(yīng)5 min，以多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)620值 (CytationTM5，BioTek)。將10 μmol/L BSA反應(yīng)組設(shè)為陰性對(duì)照組。根據(jù)磷酸標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算酶促反應(yīng)中自由磷酸 (Pi) 的釋放量和Ec-FtsZ GTPase活性 (nmol/(min·mg Ec-FtsZ))。

1.2.8 抗Ec-FtsZ多克隆抗體的制備

改進(jìn)文獻(xiàn)所述方法免疫大鼠制備抗Ec-FtsZ多克隆抗體[11-12]。首次免疫時(shí)，將Ec-FtsZ (200 μg/(次·只)) 與等體積Freund完全佐劑混合，充分乳化后進(jìn)行Wistar大鼠皮下多點(diǎn)注射。首次免疫3周后進(jìn)行第2次免疫，用Freund不完全佐劑充分乳化后的Ec-FtsZ進(jìn)行皮下注射。第2次免疫后的第7 天，從大鼠尾尖部少量采血后分離血清，以ELISA法進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。當(dāng)抗血清效價(jià)達(dá)到1∶70 000，則從全血中分離抗血清備用。

1.2.9 抗Ec-FtsZ多克隆抗體效價(jià)測(cè)定

按照文獻(xiàn)所述方法進(jìn)行抗Ec-FtsZ多克隆抗體效價(jià)測(cè)定[12]。首先將Ec-FtsZ (10 μg/mL) 以100 μL/孔包被至96孔酶標(biāo)板，酶標(biāo)板經(jīng)10% BSA封閉后，依次加入以2倍倍比稀釋法稀釋的共11個(gè)濃度梯度的大鼠抗血清 (1∶1 000–1∶1 024 000；100 μL/孔)，每組3個(gè)復(fù)孔，以相同稀釋倍數(shù)的大鼠免疫前血清作為陰性對(duì)照組，室溫孵育1 h。酶標(biāo)板經(jīng)HRP-羊抗大鼠IgG (1∶4 000) 孵育和TMB顯色后，以多功能酶標(biāo)儀測(cè)定450值。S/N=稀釋抗血清/陰性對(duì)照組，判定S/N≥3.0的樣品為陽性樣品。

1.2.10 抗Ec-FtsZ多克隆抗體抗原特異性鑒定

純化的Ec-FtsZ (1、2、4 μg) 經(jīng)10% SDS-PAGE后轉(zhuǎn)膜，一抗為大鼠抗Ec-FtsZ多克隆抗體 (1∶10 000)，二抗為HRP-羊抗大鼠IgG (1∶4 000)，以TanonTM化學(xué)發(fā)光液成像。

以煮沸法裂解大腸桿菌.BL21(DE3)、.BL21(DE3) pLysS和.Rosetta (DE3)細(xì)胞，同法檢測(cè)細(xì)胞裂解液中的內(nèi)源Ec-FtsZ。

1.2.11 免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析Ec-FtsZ亞細(xì)胞定位

將大腸桿菌.BL21(DE3)細(xì)胞以2.5%多聚甲醛和0.04%戊二醛固定后，以含0.3% Tween-20的PBS (Phosphate buffered saline) 溶液 (PBST) 洗滌3次。經(jīng)10% BSA封閉2 h后，依次加入大鼠抗Ec-FtsZ多克隆抗體 (1∶10 000) 和FITC-山羊抗大鼠IgG (1∶100)，室溫孵育45 min，PBST洗滌3次，以熒光顯微鏡 (Life EVOS) 觀察Ec-FtsZ的亞細(xì)胞定位。

2 結(jié)果與分析

2.1 Ec-FtsZ原核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

用Ⅰ和Ⅰ酶切構(gòu)建的重組質(zhì)粒Ec-FtsZ-pET-22b(+)，得到了約1 152 bp的基因片段，其大小與基因片段理論值一致 (圖1)，表明成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒Ec-FtsZ-pET-22b(+)。

圖1 重組質(zhì)粒Ec-FtsZ-pET-22b(+)的雙酶切鑒定

2.2 Ec-FtsZ的原核表達(dá)

6株工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，收集的菌體經(jīng)10% SDS-PAGE分析表明，在Ec-FtsZ理論分子量位置 (42 kDa) 可見明顯的蛋白表達(dá)條帶 (圖2)，這說明成功進(jìn)行了Ec-FtsZ原核表達(dá)。

2.3 Ec-FtsZ最適誘導(dǎo)時(shí)間的確定

工程菌以不同的誘導(dǎo)時(shí)間培養(yǎng)后，等量收集菌體，以10% SDS-PAGE鑒定Ec-FtsZ表達(dá)情況。在誘導(dǎo)溫度為30 ℃ (圖3A)、25 ℃ (圖3B) 和20 ℃ (圖3C) 時(shí)，Ec-FtsZ均明顯表達(dá)。以上述誘導(dǎo)溫度分別誘導(dǎo)工程菌6 h，Ec-FtsZ表達(dá)量均達(dá)30%，趨于蛋白表達(dá)量最高峰。因此確定Ec-FtsZ在30 ℃、25 ℃和20 ℃誘導(dǎo)時(shí)，其最適誘導(dǎo)時(shí)間為6 h。

2.4 Ec-FtsZ最適誘導(dǎo)溫度的確定

等量收集30 ℃、25 ℃、20 ℃誘導(dǎo)6 h的菌體，菌體裂解上清液和沉淀經(jīng)10% SDS-PAGE分析表明，與30 ℃誘導(dǎo)6 h時(shí)相比，25 ℃和20 ℃誘導(dǎo)6 h時(shí)，Ec-FtsZ包涵體量明顯減少，目的蛋白大部分在上清中呈可溶表達(dá) (圖4)。因此確定Ec-FtsZ最適誘導(dǎo)溫度為25 ℃。

圖2 Ec-FtsZ的原核表達(dá)

圖3 Ec-FtsZ最適誘導(dǎo)時(shí)間的確定

2.5 Ec-FtsZ最適IPTG誘導(dǎo)濃度的確定

SDS-PAGE結(jié)果表明，IPTG對(duì)Ec-FtsZ表達(dá)的誘導(dǎo)效率較高，0.2 mmol/L IPTG即可誘導(dǎo)Ec-FtsZ大量表達(dá) (圖5)。

綜上所述，以0.2 mmol/L IPTG于25 ℃誘導(dǎo)6 h作為Ec-FtsZ最適表達(dá)條件。

圖4 Ec-FtsZ最適誘導(dǎo)溫度的確定

圖5 Ec-FtsZ最適IPTG誘導(dǎo)濃度的確定

2.6 Ec-FtsZ的分離純化與鑒定

工程菌菌體裂解上清液首先用25%飽和硫酸銨溶液沉淀后制備粗提液，粗提液經(jīng)過濾后再以HisTrap層析柱進(jìn)行分離純化。SDS-PAGE結(jié)果顯示，在相對(duì)分子量42 kDa左右呈單一蛋白條帶，說明獲得了具有較高純度的Ec-FtsZ (圖6A)。Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)了Ec-FtsZ的正確表達(dá) (圖6B)。BCA法測(cè)定純化的Ec-FtsZ濃度為1.3 mg/mL。

2.7 Ec-FtsZ GTPase活性測(cè)定

Ec-FtsZ具有GTPase活性，能夠水解GTP為GDP和自由磷酸 (Pi)?？兹妇G試劑能與Pi結(jié)合形成綠色復(fù)合物，且復(fù)合物量與620值呈正相關(guān)，故此可以用反應(yīng)體系Pi釋放量反映Ec-FtsZ GTPase活性[4,9]?？兹妇G法酶活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)表明，與BSA對(duì)照組相比，隨著GTP濃度的不斷升高，Ec-FtsZ GTPase活性越來越強(qiáng)，最大酶活力可達(dá)6 nmol/ (min·mg Ec-FtsZ) (圖7)。

圖6 Ec-FtsZ的分離純化與鑒定

2.8 抗Ec-FtsZ多克隆抗體的制備與效價(jià)測(cè)定

以純化的Ec-FtsZ為抗原免疫大鼠，在第2次加強(qiáng)免疫后第7天抗體滴度基本達(dá)到峰值。當(dāng)抗血清稀釋至256 000倍時(shí)，S/N值為3.15，抗Ec-FtsZ多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶256 000 (圖8)，這表明純化的Ec-FtsZ具有良好的免疫原性，制備的抗Ec-FtsZ多克隆抗體具有較高的滴度。

2.9 抗Ec-FtsZ多克隆抗體的抗原特異性鑒定

將抗Ec-FtsZ多克隆抗體 (1∶10 000) 作為一抗，分別與純化的Ec-FtsZ和大腸桿菌內(nèi)源Ec-FtsZ反應(yīng)，以Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其抗原特異性。結(jié)果顯示，純化的Ec-FtsZ在相對(duì)分子量42 kDa左右顯現(xiàn)特異條帶，條帶亮度與Ec-FtsZ劑量呈正相關(guān) (圖9A)。另外，在大腸桿菌BL21(DE3)、BL21(DE3) pLysS 和Rosetta (DE3)細(xì)胞裂解液中也同樣檢測(cè)到了相同分子量的特異條帶 (圖9B)。綜上所述，抗Ec-FtsZ多克隆抗體不僅可以識(shí)別純化的Ec-FtsZ，還可以特異性結(jié)合大腸桿菌內(nèi)源Ec-FtsZ，其具有良好的抗原特異性。

圖8 ELISA檢測(cè)抗Ec-FtsZ多克隆抗體效價(jià)

2.10 大腸桿菌Ec-FtsZ的亞細(xì)胞定位

通過熒光顯微鏡觀察，使用大鼠抗Ec-FtsZ多克隆抗體為一抗，以免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析大腸桿菌Ec-FtsZ亞細(xì)胞定位。結(jié)果表明，綠色熒光 (Ec-FtsZ) 主要分布于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)膜的中心，這說明Ec-FtsZ主要定位于細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜中心即Z環(huán)位置，參與大腸桿菌細(xì)胞分裂的調(diào)控 (圖10)。

3 討論

大腸桿菌FtsZ是細(xì)菌分裂過程中重要的調(diào)控蛋白，其通過GTP依賴的自組裝形成多聚體，促進(jìn)細(xì)菌分裂體和Z環(huán)結(jié)構(gòu)形成以調(diào)控細(xì)菌細(xì)胞分裂、FtsZ相對(duì)保守的細(xì)菌分裂調(diào)控模式已成為新型抗感染藥物開發(fā)的理想靶標(biāo)之一[4,7-10,13-16]。深入研究Ec-FtsZ在大腸桿菌分裂過程中的調(diào)控功能，尤其是調(diào)控細(xì)菌分裂體形成和Z環(huán)內(nèi)膜定位的分子機(jī)制，對(duì)未來新型抗耐藥菌細(xì)胞分裂抑制劑研發(fā)具有重要意義。特異性抗體對(duì)研究蛋白質(zhì)生物學(xué)功能和生化檢測(cè)具有重要作用，但目前還未有抗Ec-FtsZ抗體商品化銷售，因此制備特異性抗Ec-FtsZ抗體對(duì)Ec-FtsZ生物學(xué)功能深入研究和生化檢測(cè)具有重要意義。

圖9 Westernblotting鑒定抗Ec-FtsZ多克隆抗體的抗原特異性

圖10 免疫熒光實(shí)驗(yàn)分析Ec-FtsZ的亞細(xì)胞定位(×60)

多克隆抗體雖特異性不如單克隆抗體，但其生產(chǎn)過程簡(jiǎn)便、成本低廉且產(chǎn)量較大，因此是抗體制備的重要選擇之一。諸多研究者將大腸桿菌原核表達(dá)的重組蛋白作為抗原免疫實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 (如大鼠、小鼠、新西蘭大白兔等)，成功制備了多種特異性多克隆抗體用于實(shí)驗(yàn)研究[11-12,17-20]。本研究將基因片段克隆至pET-22b(+) 表達(dá)載體中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒Ec-FtsZ-pET-22b(+)。利用pET-22b(+) 的His標(biāo)簽羧基端融合表達(dá)策略，成功進(jìn)行了Ec-FtsZ原核表達(dá)與分離純化。由于誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)溫度與IPTG濃度是影響重組蛋白原核表達(dá)的重要因素[21-24]，為了提高Ec-FtsZ表達(dá)量并節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本，筆者對(duì)其原核表達(dá)條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化。Ec-FtsZ原核表達(dá)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)顯示，不同的誘導(dǎo)溫度對(duì)其原核表達(dá)的影響較大。30 ℃誘導(dǎo)時(shí)，Ec-FtsZ易于形成包涵體；25 ℃和20 ℃低溫誘導(dǎo)時(shí)，大部分Ec-FtsZ以可溶形式表達(dá)，這可能與低溫狀態(tài)下蛋白表達(dá)速度緩慢并促進(jìn)其正確折疊有關(guān)[24-25]。25 ℃誘導(dǎo)6 h時(shí)，Ec-FtsZ表達(dá)量可達(dá)30%并趨于穩(wěn)定，故此以25 ℃誘導(dǎo) 6 h作為Ec-FtsZ最適表達(dá)條件。IPTG作為原核表達(dá)的誘導(dǎo)劑，其對(duì)Ec-FtsZ表達(dá)的誘導(dǎo)效率很高，0.2 mmol/L IPTG即可誘導(dǎo)Ec-FtsZ大量表達(dá)。

高活性的Ec-FtsZ制備對(duì)于多克隆抗體制備和體外生物學(xué)功能研究具有重要意義?？兹妇G法是FtsZ GTPase活性檢測(cè)的經(jīng)典方法[4,9-10]，主要通過檢測(cè)反應(yīng)體系中自由磷酸濃度以反映酶的活性。該方法具有一步反應(yīng)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)靈敏和成本低廉等諸多優(yōu)點(diǎn)，不僅可以用于酶活性檢測(cè)，還可以用于Ec-FtsZ GTPase抑制劑的高通量篩選。文中利用上述方法對(duì)Ec-FtsZ GTPase活性進(jìn)行了測(cè)定，證實(shí)了純化的Ec-FtsZ具有良好的GTPase活性。

將純化的Ec-FtsZ作為抗原免疫大鼠制備多克隆抗體，以ELISA實(shí)驗(yàn)、Western blotting實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了抗Ec-FtsZ多克隆抗體效價(jià)和抗原特異性鑒定。ELISA實(shí)驗(yàn)表明抗Ec-FtsZ多克隆抗體效價(jià)可達(dá)1∶256 000，其具有較高的滴度。Western blotting實(shí)驗(yàn)證實(shí)了抗Ec-FtsZ多克隆抗體具有良好的抗原特異性，不僅可以識(shí)別純化的Ec-FtsZ，還可以特異性結(jié)合大腸桿菌內(nèi)源Ec-FtsZ。免疫熒光實(shí)驗(yàn)表明Ec-FtsZ主要分布于大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)膜中心并形成了Z環(huán)，其亞細(xì)胞定位與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[5,13,26]，這也再次證實(shí)了抗Ec-FtsZ多克隆抗體具有良好的抗原特異性。

目前，筆者將制備的抗Ec-FtsZ多克隆抗體成功應(yīng)用于以Ec-FtsZ/ZipA (FtsZ-interacting protein A，ZipA) 相互作用為靶標(biāo)的ELISA高通量篩選模型中的Ec-FtsZ生化檢測(cè)。通過應(yīng)用建立的ELISA篩選模型對(duì)本室天然產(chǎn)物化合物庫進(jìn)行了高通量篩選，已初步獲得了若干新型苗頭化合物。

綜上所述，文中成功進(jìn)行了Ec-FtsZ原核表達(dá)和抗Ec-FtsZ多克隆抗體的制備與鑒定，為進(jìn)一步研究Ec-FtsZ生物學(xué)功能和生化檢測(cè)奠定了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

致謝：衷心感謝北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院化學(xué)生物學(xué)系鄭積敏教授、中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所天然藥物活性物質(zhì)與功能國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室林媛副研究員和軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院十一所基因工程全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室岳玉環(huán)研究員在Ec-FtsZ原核表達(dá)、活性測(cè)定和多抗制備技術(shù)方面給予的悉心指導(dǎo)和無私幫助！

[1] Zhang W, Yang ZJ, Chen DJ. The research progress of FtsZ inhibitor, a target for bacteria cell-division. Chin Bull Life Sci, 2012, 22(1): 94–101 (in Chinese). 張?chǎng)? 楊志鈞, 陳代杰. 靶向FtsZ的細(xì)胞分裂抑制劑的研究進(jìn)展. 生命科學(xué), 2012, 22(1): 94–101.

[2] Krupka M, Margolin W. Unite to divide: oligomerization of tubulin and actin homologs regulates initiation of bacterial cell division. F1000Res, 2018, 7: 235.

[3] Sang Y, Tao J, Yao YF. Regulation of the Z ring positioning in bacterial cell division-A review. Acta Microbiol Sin, 2013, 53(4): 321–327 (in Chinese). 桑昱, 陶晶, 姚玉峰. 細(xì)菌分裂Z環(huán)定位的調(diào)控方式. 微生物學(xué)報(bào), 2013, 53(4): 321–327.

[4] Lin Y, Zhu NY, Jiang JD, et al. The establishment and application of a high-throughput screening (HTS) assay for inhibitors ofFtsZ. Chin J Antibiot, 2015, 40(3): 166–170, 212 (in Chinese). 林媛, 朱寧嶼, 蔣建東, 等. 以FtsZ為靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物篩選模型的建立及應(yīng)用. 中國抗生素雜志, 2015, 40(3): 166–170, 212.

[5] Erickson HP, Anderson DE, Osawa M. FtsZ in bacterial cytokinesis: cytoskeleton and force generator all in one. Microbiol Mol Biol Rev, 2010, 74(4): 504–528.

[6] Ortiz C, Natale P, Cueto L, et al. The keepers of the ring: regulators of FtsZ assembly. FEMS Microbiol Rev, 2016, 40(1): 57–67.

[7] Yang SY, Zhu J, Wu Y, et al. Purification and crystallization of MinC/FtsZ complex in. Chemistry, 2017, 80(1): 89–93 (in Chinese). 楊少媛, 朱嘉, 吳彥, 等. 大腸桿菌MinC/FtsZ蛋白復(fù)合物的純化和結(jié)晶. 化學(xué)通報(bào), 2017, 80(1): 89–93.

[8] Kapoor S, Panda D. Targeting FtsZ for antibacterial therapy: a promising avenue. Expert Opin Ther Targets, 2009, 13(9): 1037–1051.

[9] Lin Y, Zhu NY, Han YX, et al. Identification of anti-tuberculosis agents that target the cell-division protein FtsZ. J Antibiot (Tokyo), 2014, 67(9): 671–676.

[10] Lin Y, Zhang HJ, Zhu NY, et al. Identification of TB-E12 as a novel FtsZ inhibitor with anti-tuberculosis activity. Tuberculosis, 2018, 110: 79–85.

[11] Zhang QS, Yuan RL, Jing SR. Expression and purification of Norovirus capsid protein VP1 and preparation of the polyclonal antibodies. Chin J Microecol, 2017, 29(8): 896–899, 905 (in Chinese). 仉秋實(shí), 苑榮亮, 井申榮. 諾如病毒NV衣殼蛋白VP1表達(dá)純化及多克隆抗體的制備. 中國微生態(tài)學(xué)雜志, 2017, 29(8): 896–899, 905.

[12] Chen YY, Niu XY, Lin Y, et al. Prokaryotic expression, purification and preparation of rat polyclonal antibody againstZipA. Chin J Cell Mol Immunol, 2018, 34(10): 942–948 (in Chinese).陳云雨, 牛夏憶, 林媛, 等. 大腸桿菌絲狀熱敏蛋白Z相互作用蛋白A (Ec-ZipA) 原核表達(dá)、純化與大鼠多克隆抗體的制備. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志, 2018, 34(10): 942–948.

[13] Ray S, Jindal B, Kunal K, et al. BT-benzo-29 inhibits bacterial cell proliferation by perturbing FtsZ assembly. FEBS J, 2015, 282(20): 4015–4033.

[14] Artola M, Ruiz-Avila LB, Vergo?ós A, et al. Effective GTP-replacing FtsZ inhibitors and antibacterial mechanism of action. ACS Chem Biol, 2015, 10(3): 834–843.

[15] Xiao J, Goley ED. Redefining the roles of the FtsZ-ring in bacterial cytokinesis. Curr Opin Microbiol, 2016, 34: 90–96.

[16] Panda D, Bhattacharya D, Gao QH, et al. Identification of agents targeting FtsZ assembly. Future Med Chem, 2016, 8(10): 1111–1132.

[17] Wu FF, Cao ZG, Wang Q, et al. Prokaryotic expression of Zaire Ebola virus GP and the preparation of polyclonal antibody. Chin J Vet Sci, 2018, 38(3): 496–501 (in Chinese). 吳芳芳, 曹增國, 王琪, 等. 扎伊爾型埃博拉病毒糖蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體的制備. 中國獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2018, 38(3): 496–501.

[18] Sun T, Yang GW, Zhang JY, et al. Prokaryotic expression of Hepatitis C Virus (HCV) NS3 protein and preparation of polyclonal antibody. Chin J Biotech, 2015, 31(5): 711–721 (in Chinese). 孫濤, 楊光文, 張金陽, 等. 丙型肝炎病毒NS3蛋白的原核表達(dá)及多克隆抗體制備. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(5): 711–721.

[19] Wang H, Yang B, Zhao KS, et al. Preparation and identification of polyclonal antibodies againstUspA1. Chin J Biotech, 2018, 34(1): 102–109 (in Chinese). 王輝, 楊波, 趙可勝, 等. 卡他莫拉菌UspA1蛋白多克隆抗體的制備及鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2018, 34(1): 102–109.

[20] Qin YJ, Zhang TH, Ye X. Preparation and detection of anti-influenza A virus polymerase basic protein 1 polyclonal antibody. Chin J Biotech, 2016, 32(1): 105–113 (in Chinese). 秦玉潔, 張廷虹, 葉昕. 抗A型流感病毒聚合酶堿性蛋白1多克隆抗體的制備和鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2016, 32(1): 105–113.

[21] Hayat SMG, Farahani N, Golichenari B, et al. Recombinant protein expression in(.): What we need to know. Curr Pharm Des, 2018, 24(6): 718–725.

[22] Baeshen MN, Al-Hejin AM, Bora RS, et al. Production of biopharmaceuticals in.: Current scenario and future perspectives. J Microbiol Biotechnol, 2015, 25(7): 953–962.

[23] Papaneophytou CP, Kontopidis G. Statistical approaches to maximize recombinant protein expression in: A general review. Protein Expr Purif, 2014, 94: 22–32.

[24] Su P, Gong GL. Research progress on optimizing the expression of exogenous proteins in. Biotechnol Bull, 2017, 33(2): 16–23 (in Chinese). 蘇鵬, 龔國利. 優(yōu)化大腸桿菌表達(dá)外源蛋白的研究進(jìn)展. 生物技術(shù)通報(bào), 2017, 33(2): 16–23.

[25] Overton TW. Recombinant protein production in bacterial hosts. Drug Discov Today, 2014, 19(5): 590–601.

[26] Haranahalli K, Tong S, Ojima I. Recent advances in the discovery and development of antibacterial agents targeting the cell-division protein FtsZ. Bioorg Med Chem, 2016, 24(24): 6354–6369.

Bacterial expression, preparation and identification of polyclonal antibody againstFtsZ

Yunyu Chen1, Xiayi Niu1, Miao Li1, Ni Li2, and Xiaoping Liu1

1 Research Institute for Pharmaceutical Screening & Evaluation, Wannan Medical College, Wuhu 241002, Anhui, China 2 State Key Laboratory of Bioactive Substances and Function of Natural Medicine, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

To prepare polyclonal antibody (PcAb) againstfilamentous thermosensitive protein Z (Ec-FtsZ), the artificially synthesized gene fragment coding Ec-FtsZ was subcloned into pET-22b(+) plasmid, and Ec-FtsZ protein was expressed in.BL21(DE3) cell under an optimal bacterial expression condition. Then Ec-FtsZ protein was purified by HisTrap affinity chromatography, and the GTPase (Guanosine triphosphatase) activity of purified Ec-FtsZ protein was further analyzed by malachite green assay. Subsequently, the purified Ec-FtsZ protein was used to immunize rat subcutaneously for preparation of anti-Ec-FtsZ PcAb. The results of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blotting analysis and immunofluorescence assay showed that the titer of PcAb was 1:256 000, and PcAb exhibited a perfect antigenic specificity against purified and endogenous Ec-FtsZ protein. All these data indicated that the anti-Ec-FtsZ PcAb is successfully prepared, which can be used for further cellular function study and biochemical analysis of Ec-FtsZ protein.

FtsZ protein, bacterial expression, malachite green assay, immunofluorescence assay, polyclonal antibody

January 6, 2019;

March 11, 2019

National Natural Science Foundation of China (Nos. 81503065, 81703546), Anhui Provincial Natural Science Foundation (No. 1808085QH265), Jilin Scientific and Technological Development Program (No. 20160520045JH), The Doctoral Starting-up Fund of Wannan Medical College (No. RCQD201617), College Student Innovation Fund of Wannan Medical College (No. WK2018S54).

Xiaoping Liu. Tel: +86-553-3932601; Fax: +86-553-3932622; E-mail: liuxiaoping@wnmc.edu.cn

Ni Li. Tel: +86-10-83162728; Fax: +86-10-63180604; E-mail: linineon@126.com

國家自然科學(xué)基金 (Nos. 81503065，81703546)，安徽省自然科學(xué)基金 (No. 1808085QH265)，吉林省科技發(fā)展計(jì)劃 (No. 20160520045JH)，皖南醫(yī)學(xué)院博士科研啟動(dòng)基金 (No. RCQD201617)，皖南醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科研資助金 (No. WK2018S54) 資助。

2019-03-19

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.q.20190318.1733.004.html

10.13345/j.cjb.190011

陳云雨, 牛夏憶, 李淼, 等. 大腸桿菌FtsZ蛋白原核表達(dá)及多克隆抗體的制備與鑒定. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(6): 1117–1125.

Chen YY, Niu XY, Li M, et al. Bacterial expression, preparation and identification of polyclonal antibody againstFtsZ. Chin J Biotech, 2019, 35(6): 1117–1125.

(本文責(zé)編 陳宏宇)