徐玉玲　賀楨翔　劉錢　曾奇璐　曹鑫　呂海洋　劉濤

摘要：通過生物活性檢測結(jié)合化學(xué)指紋圖譜分析，探索紅花注射液抗凝血活性成分。以紅花注射液為研究對象，測定7批紅花注射液的指紋圖譜和抗凝血活性值，再基于StatisticalProductandServiceSolutions軟件，運用主成分分析-相關(guān)性分析-多重線性回歸的分析方法對抗凝血活性值和色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)建立譜-效回歸評價模型，另取6批紅花注射液對模型進行驗證。納入模型的6個自變量對抗凝血活性能力的影響均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），預(yù)測值和實測值的相對誤差均在10%以內(nèi)。建立的譜-效回歸模型可較好地通過紅花注射液圖譜數(shù)據(jù)評價其抗凝血生物活性。關(guān)鍵詞：紅花注射液;指紋圖譜;抗凝血活性;回歸模型;譜-效關(guān)系

中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1674–5124（2019）02–0059–05

0 引言

紅花注射液由紅花（Carthamus tinctoriusL.）經(jīng)水煮醇沉工藝加工而成，具有活血化瘀之功效，臨床用于閉塞性腦血管等疾病的治療[1]。紅花注射液現(xiàn)行標準及相關(guān)質(zhì)量研究文獻主要集中于對其個別化學(xué)成分，如羥基紅花黃色素A的定量測定與特征圖譜研究等方面[2]。由于中藥注射液成分復(fù)雜，臨床使用時安全風(fēng)險較大，控制個別成分含量無法控制藥品的安全性、有效性和穩(wěn)定性[3]。在一定波長下建立的指紋圖譜可在一定程度上反應(yīng)藥品質(zhì)量均一性及穩(wěn)定性[4]。但是，中藥指紋圖譜僅控制了檢視波長下可測定的成分，卻并不能標示哪些成分與藥物的藥效相關(guān)，也并不能體現(xiàn)其相關(guān)程度;因此，只利用指紋圖譜來評價中藥質(zhì)量還有較大局限性[5]。只有根據(jù)藥物的基本屬性，以藥效為基準，并定量或定性控制與臨床療效相關(guān)的化學(xué)成分建立的藥物質(zhì)量標準，才能更好地評價中藥質(zhì)量，而中藥譜-效相關(guān)性研究可以達到這一目的。譜-效關(guān)系研究由3個階段組成，一是建立指紋圖譜，二是建立藥效學(xué)方法，三是采用合適的數(shù)據(jù)處理方法將指紋峰與藥效數(shù)據(jù)進行關(guān)聯(lián)分析，從而建立譜-效模型。

本研究通過建立紅花注射液的HPLC指紋圖譜，并采用纖維蛋白原平板法，以抗凝血效應(yīng)強度為指標，對紅花注射液抗凝血作用強度進行測定[6]，運用“主成分分析-相關(guān)性分析-多重線性回歸”的分析方法，對紅花注射液抗凝血活性值和色譜指紋圖譜數(shù)據(jù)建立譜-效回歸評價模型，可以實現(xiàn)對藥效作用的預(yù)測和評價。同時也可闡明指紋圖譜特征與藥效的相互關(guān)系，確定相應(yīng)的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，更有針對性地控制中藥質(zhì)量。

1 材料

iChrom P5100型高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）;HS-3120超聲波清洗器;JJ-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇州市金凈凈化設(shè)備科技有限公司）;DH系列電熱恒溫培養(yǎng)箱（西安禾普生物科技有限公司）;XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌器（浙江新豐醫(yī)療器械有限公司）。

凝血酶試劑（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，批號T20180401）;牛血纖維蛋白原試劑（上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司，批號F20180401）;氯化鈉注射液（四川科倫藥業(yè)股份有限公司，批號N17122008-1）;紫丁香苷對照品（四川省維克奇生物科技有限公司，批號180218）。

13批紅花注射液：公司A，批號170502、170701、170702、171001、171002、180101、180102、180401、180402、180403、180404;公司B，批號170314;公司C，批號170301。

2 方法與結(jié)果

2.1 紅花注射液抗凝血活性值的測定

2.1.1 供試品溶液的制備

將紅花注射液與32U/mL凝血酶按1∶1混合，混合反應(yīng)30min后即供試品溶液。

2.1.2 纖維蛋白原平板的制備

取經(jīng)高壓蒸汽滅菌后的直徑為10cm的平皿，分別依次加入加熱至85°C的1%瓊脂溶液20mL，0.3%的纖維蛋白原溶液15mL，輕輕搖勻，冷卻靜置30min，分別打出直徑為3.5mm的孔，備用[7]。

2.1.3 對照品溶液及陰性樣品的制備

精密稱取活性為10000U的凝血酶粉末適量，用生理鹽水配制濃度為40U/mL的溶液，備用。陰性樣品為純凈水。

2.1.4 標準曲線的繪制

根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，取纖維蛋白平板，分別精密吸取25μL質(zhì)量濃度2，4，6，8，10U/mL的凝血酶溶液點樣，置于恒溫培養(yǎng)箱中（37°C）培養(yǎng)16h，測定沉淀圈，以凝血酶濃度（U/mL）為橫坐標（X），沉淀圈面積（mm2）為縱坐標（Y），得線性方程為Y=7.3386X+31.939，r2=0.9991。結(jié)果表明，凝血酶在2～10U/mL與沉淀圈面積呈良好的線性關(guān)系。取纖維蛋白平板，分別精密吸取25μL質(zhì)量濃度8，16，24，32，40U/mL的凝血酶點樣，置于恒溫培養(yǎng)箱中（37°C）培養(yǎng)16h，測定沉淀圈，以凝血酶濃度（U/mL）為橫坐標（X），沉淀圈面積（mm2）為縱坐標（Y），得線性方程為Y=5.6685X+65.82，r2=0.994。結(jié)果表明，凝血酶在8～40U/mL與沉淀圈面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.5 精密度試驗

1）同板精密度試驗：取紅花注射液（批號：170701）1mL，按2.1.1方法制備供試品溶液，精密吸取25μL，取纖維蛋白原平板，同板點樣，共點6次，同時點樣2，8，40U/mL的凝血酶、生理鹽水、純凈水各25μL，置于恒溫培養(yǎng)箱中（37°C）培養(yǎng)16h，測定抗凝血活性值，計算其RSD值為4.44%，結(jié)果表明同板精密度良好。

2）異板精密度試驗：取紅花注射液（批號：170701）1mL，按2.1.1項方法制備供試品溶液，精密吸取25μL，取纖維蛋白原平板，異板點樣，共點6次，同時點樣2，8，40U/mL的凝血酶、生理鹽水、純凈水各25μL，置于恒溫培養(yǎng)箱中（37°C）培養(yǎng)16h，測定抗凝血活性值，計算其RSD值為2.88%，結(jié)果表明異板精密度良好。

2.1.6 重復(fù)性試驗

取紅花注射液（批號：170701）各1mL，按2.1.1項方法分別平行制備6份供試品溶液，精密吸取25μL，取纖維蛋白原平板，同板點樣，同時點樣2，8，40U/mL的凝血酶、生理鹽水、純凈水各25μL，于恒溫培養(yǎng)箱中（37°C）培養(yǎng)16h，測定抗凝血活性值，計算RSD值為2.09%，結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗

取紅花注射液（批號：170701）各1mL，按2.1.1項方法制備6份供試品溶液，精密吸取25μL，取6個纖維蛋白原平板，凝血酶與供試品混合30min后于0，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h后分別點樣，并同時點樣2，8，40U/mL的凝血酶、生理鹽水、純凈水各25μL，于恒溫培養(yǎng)箱中（37°C）培養(yǎng)16h，測定抗凝血活性值，計算其RSD值為4.48%，結(jié)果表明樣品在3h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗

精密吸取紅花注射液（批號170502，抗凝血活性值為10.71U/mL）6份，每份與32U/mL凝血酶按1∶1混合30min后，再與20U/mL凝血酶按1∶1混合30min，取纖維蛋白原平板，同板點樣，同時點樣2，8，40U/mL的凝血酶、生理鹽水、純凈水各25μL，于恒溫培養(yǎng)箱中（37°C）培養(yǎng)16h，測定抗凝血活性值，計算加樣回收率為105.26%，RSD值為1.20%。

2.1.9 樣品活性測定

按2.1.1項方法制備7份供試品溶液（批號170502、170701、170702、171001、171002、180101、108102），取纖維蛋白原平板，同板點樣，同時點樣2，8，40U/mL的凝血酶、生理鹽水、純凈水各25μL，置于恒溫培養(yǎng)箱中（37°C）培養(yǎng)16h，測定抗凝血活性值。測定結(jié)果如圖1、表1所示。

2.2 紅花注射液化學(xué)成分群數(shù)據(jù)庫的建立

2.2.1 紅花注射液供試品溶液的制備

精密移取紅花注射液5.0mL置于10mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，既得供試品溶液。

2.2.2 色譜條件

色譜柱為SupersilODS2色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為甲醇（A）-10mL/L冰醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～90min，0%～70%A）;體積流量1.0mL/min，進樣體積10μL;檢驗波長270nm;柱溫30°C。

2.2.3 穩(wěn)定性試驗

取紅花注射液（批號170701）按2.2.1項方法制備供試品溶液，將同一供試品溶液分別于0，3，6，9，12，15，18，21，24h進樣分析，計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間，其RSD值分別小于2.00%和1.00%，以0h的圖譜數(shù)據(jù)作為參照，相似度RSD值小于1%，結(jié)果表明供試品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 精密度試驗

取紅花注射液（批號170701）按2.2.1項方法制備供試品溶液，同一供試品溶液重復(fù)進樣5次，計算各共有峰相對峰面積和相對保留時間，其RSD值分別小于2.00%和1.00%，以第1次進樣的圖譜數(shù)據(jù)作為參照，相似度RSD值小于1%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗

取紅花注射液（批號170701）按2.2.1項方法平行制備供試品溶液5份，進樣分析，計算各共有峰相對峰面積及相對保留時間，其RSD值分別小于2.00%和1.00%，以第1份供試品的圖譜數(shù)據(jù)作為參考，相似度RSD值小于1%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.6 化學(xué)成分群圖譜的構(gòu)建

取7批紅花注射液，分別按照2.2.1項方法平行制備供試品溶液，按2.2.2項色譜方法測定。通過“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版”對數(shù)據(jù)進行分析[8]，生成紅花注射液指紋圖譜的共有模式，確定了8個共有峰，如圖2所示。7批紅花注射液指紋圖譜見圖3。其中6號峰為紫丁香苷對照品，其液相色譜圖見圖4。

2.3“紅花注射液譜-效相關(guān)性分析

2.3.1 最優(yōu)主成分數(shù)的確定

采用“Statistical Product and Service Solutions”（SPSS）中“Reduction”的“Factor”考察最優(yōu)主成分數(shù)，最優(yōu)主成分確定根據(jù)解釋數(shù)據(jù)變異的比例、前幾位主成分解釋數(shù)據(jù)變異的總比例和陡坡圖檢驗[9]。結(jié)果見表2和圖5。由圖、表可知，當(dāng)主成分數(shù)為6時，前6位主成分解釋數(shù)據(jù)變異的總比例為100%，且陡坡圖在第6主成分之后趨于平緩;因此，該分析模型的最優(yōu)主成分數(shù)為6。

2.3.2 主成分的確定

運用SPSS中“Correlate Bivariates”的“Pearson”分析各共有峰和抗凝血活性強弱的關(guān)系[10]，根據(jù)兩連續(xù)變量間相關(guān)的強弱確定主成分為峰2、3、4、6、7、8。各共有峰和抗凝血活性相關(guān)性強弱結(jié)果見表3。

2.3.3 譜-效相關(guān)數(shù)學(xué)模型的構(gòu)建

運用SPSS中“Regression”的“Linear”，以峰面積為X，抗凝血活性為Y，采用多重線性回歸，建立譜-效相關(guān)性評價模型，計算各共有峰的標準化回歸系數(shù)，結(jié)果見表4?；貧w方程可以表示為：Y=9.696158+0.006147峰2?0.009241峰3?0.016023峰4+0.005000峰6+0.006512峰7?0.001052峰8。納入模型的6個自變量對抗凝血活性能力的影響均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。

2.4 紅花注射液譜-效評價模型的驗證

另取6批紅花注射液，測定其抗凝血活性值，對已建立的譜-效評價模型的準確性和適用性進行驗證，結(jié)果見表5。結(jié)果顯示6批驗證紅花注射液抗凝血活性的模型預(yù)測值與實際測量值的相對誤差在10%之內(nèi)，結(jié)果表明建立的模型對紅花注射液抗凝血活性值具有較好的評價效果。

3 結(jié)束語

紅花注射液目前執(zhí)行標準為WS3-B-3825-98-2012，其標準中僅對羥基紅花黃色素A和總黃酮進行了定量測定。但是，中藥的療效并不是單一成分或幾個成分的藥效體現(xiàn)，而是眾多成分的協(xié)同藥效作用體現(xiàn)，因此，對單一成分或大類成分的質(zhì)量控制，并不能控制中藥的內(nèi)在真實質(zhì)量。

紅花注射液具有抗凝血作用，本實驗采用纖維蛋白平板法間接地反映其活血作用[11-12]，從而達到對其藥效進行量化的目的。實驗結(jié)果顯示紫丁香苷是紅花注射液抗凝血效果的活性成分（相關(guān)性強弱為0.431，標準化回歸系數(shù)為0.005），在所考察出的色譜條件下只能確定出一種成分，羥基紅花黃色素A在確定的檢驗波長條件下峰面積較小，數(shù)據(jù)不適用于進行模型的構(gòu)建，后續(xù)研究會結(jié)合UPLC-Q-TOF/MS法對其成分及其活性進行確認。

譜-效分析可在某種程度上闡明中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，建立反映中藥內(nèi)在質(zhì)量的控制方法。但目前譜效分析研究多關(guān)注中藥化學(xué)指紋圖譜與體外活性的相關(guān)性，而中藥在臨床多需要服用，成分吸收入血后才能發(fā)揮預(yù)防治療作用[13]。目前研究人員多采用HPLC法建立指紋圖譜，而采用紅外、紫外及近紅外建立的指紋圖譜可以反映更豐富的化學(xué)成分信息，因此在后續(xù)的研究中可用在體動物藥效指標，結(jié)合各類指紋圖譜（HPLC、紅外、近紅外及紫外圖譜）數(shù)據(jù)建立模型，并進行相關(guān)性分析。本實驗在建立模型時運用了主成分分析、相關(guān)分析和回歸分析3種分析方法，但每種分析方法都存在不足，如主成分分析通過數(shù)學(xué)降維的方法減少了分析變量，揭示了每組變量的主要因素，卻不能給出2組變量間的相關(guān)性大小和建立數(shù)學(xué)模型，故常與其他統(tǒng)計學(xué)方法聯(lián)合使用;相關(guān)分析法給出了每個色譜峰與藥效指標的密切程度和變化方向，但卻忽略了中藥作用的整體性，不能解釋各個色譜峰對藥效的協(xié)同作用;因此，其譜-效研究分析方法的選擇要根據(jù)研究數(shù)據(jù)進行具體選擇。

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