孫牧笛，胡麗杰，李文學，閆思遠，張 眾，顧沛雯

(1.寧夏大學農(nóng)學院,寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學葡萄酒學院,寧夏 銀川 750021)

關(guān)鍵字：苦豆子；內(nèi)生真菌誘導子;氧化苦參堿; 防御酶活性；組培苗

植物內(nèi)生真菌是生長于植物體內(nèi)，與宿主植物互利共生的一類微生物，內(nèi)生真菌誘導子作為一種特殊的外源誘導子，可以通過信號傳導途徑，誘發(fā)植物自身的防御反應，調(diào)節(jié)次生代謝途徑中某些關(guān)鍵酶活性，從而高效、快速、專一地調(diào)控某些次生代謝物的合成[1-3]。將真菌誘導子作用于植物培養(yǎng)物，通過激活植物防御而促進次生代謝物的合成是目前提高植物次生代謝物產(chǎn)率最有效的技術(shù)手段之一[4]。

植物次生代謝產(chǎn)物的合成與積累是植物應對外界脅迫所產(chǎn)生的防御反應的一個分支，因此植物的防御反應與植物次生代謝產(chǎn)物的合成關(guān)系密切[5]。防御酶活力的提高在一定程度上代表著植物細胞次級代謝的增強，酶活性的提高有利于植物中次生代謝產(chǎn)物的合成和積累[6]。李培琴等[7]利用盾葉薯蕷內(nèi)生真菌Berkleasmiumsp. Dzf 12寡糖誘導子，明顯促進了盾葉薯蕷培養(yǎng)物中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的活性升高。王夢亮等[8]通過向紅景天組培苗中添加內(nèi)生真菌的提取物，不僅誘發(fā)紅景天苷合成途徑中關(guān)鍵酶PAL、酪氨酸脫羧酶(TAL)和肉桂酸-4-羥化酶(CA4H)活性升高，還促進了紅景天苷的合成積累。

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)系豆科(Leguminosae)槐屬多年生草本植物，主要分布于我國的西北荒漠地區(qū)及中亞細亞一帶，是我國干旱荒漠區(qū)具有保土固沙作用的重要自然植被，同時也是中醫(yī)藥領(lǐng)域中重要的沙生藥用植物資源[9]。喹諾里西啶(Quinolizidine，QAs)類生物堿是其重要的生物活性成分，其中的氧化苦參堿(Oxymatrine，OMA)在保肝、抗炎抗敏、抗腫瘤及抗心律失常等方面有重要的藥理活性，在殺蟲抗菌等方面也有著重要的作用[10]。近年來，由于人們對苦豆子OMA等原料藥的需求量逐漸增加，野生苦豆子資源亂采濫掘日益猖獗，苦豆子野生自然資源面臨著逐漸枯竭的危險。本課題組在前期實驗中從寧夏野生苦豆子中篩選獲得了可產(chǎn)生QAs生物堿的內(nèi)生真菌[11]，并以苦豆子內(nèi)生真菌產(chǎn)堿菌株、優(yōu)勢菌株和高活性抑菌菌株的滅活菌絲和菌液濃縮物為誘導子，發(fā)現(xiàn)菌液濃縮物能明顯提高宿主培養(yǎng)物中QAs生物堿的合成積累[12]，本研究在此基礎(chǔ)上，以苦豆子組培苗為對象，以4株高活性苦豆子內(nèi)生真菌的菌液濃縮物為誘導子，分析其對苦豆子組培苗中OMA合成和防御酶活性的影響，探究內(nèi)生真菌促進生物堿合成積累的生理防衛(wèi)反應機制。

1 材料與方法

1.1 材 料

植物材料：苦豆子豆莢采自寧夏白芨灘自然保護區(qū)，經(jīng)寧夏大學農(nóng)學院李小偉副教授鑒別證明為SophoraalopecuroidesL.。

苦豆子內(nèi)生真菌菌株：本實驗室篩選得到4株高活性苦豆子內(nèi)生真菌(表1)，分別為菌株XKZKDF11，菌株XKZKDF27，菌株XKYKDF40和菌株NDZKDF13。

表1 供試苦豆子內(nèi)生真菌菌株

主要試劑：氧化苦參堿OMA標準品(批號：B21470)購自上海源葉生物技術(shù)有限公司，苯丙氨酸解氨酶(PAL)試劑盒、抗壞血酸過氧化物酶(APX)試劑盒、過氧化氫酶(CAT)試劑盒、過氧化物酶(POD)試劑盒、BCA法微量蛋白檢測試劑盒，以上試劑盒皆購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方 法

1.2.1 苦豆子組培苗的培養(yǎng) 按高媛等[12]的方法培養(yǎng)苦豆子組培苗。飽滿健康的種子經(jīng)過80%濃硫酸(V/V)軟化種皮和5%次氯酸鈉(V/V)消毒處理后，暗培養(yǎng)24 h，每天連續(xù)光照12 h，培育5 d后用5%次氯酸鈉(V/V)再次對幼苗消毒，接種于MS培養(yǎng)基上。培養(yǎng)條件為：25℃，每天連續(xù)光照12 h，光強為1 000 lx，組培苗每25 d繼代1次。

1.2.2 內(nèi)生真菌誘導子的制備與添加 真菌誘導子的制備參照Farmer[13]的方法，將內(nèi)生真菌菌株接種于馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25℃，150 r·min-1恒溫搖床中暗培養(yǎng)7 d，對獲取的菌株發(fā)酵液進行抽濾，分離得到菌液后，經(jīng)過減壓濃縮，獲得菌液濃縮物。真菌誘導子的濃度以多糖濃度為標準，向組培苗的MS培養(yǎng)基中添加一定量的菌液濃縮物，使培養(yǎng)基中多糖濃度為1.00 mg·L-1，高壓滅菌后備用。以不加誘導子組培苗為對照，25℃培養(yǎng)，各處理組每天連續(xù)光照12 h，光強為1 000 lx，包括添加誘導子當天在內(nèi)每3 d取1次樣本，共取樣6次，液氮速凍后，-80℃保存。

1.2.3 苦豆子組培苗中OMA含量測定

(1)苦豆子組培苗中OMA的提取。稱取0.5 g苦豆子組培苗子葉，加入2 mL無水乙醇充分研磨，常溫水浴超聲處理30 min，置于4℃冰箱過夜浸提，于25℃ 8 000 g離心10 min，取上清液于新離心管中，氮吹后，用流動相定容至1.5 mL，0.45 μm濾膜過濾后，即為樣品制備液，于4℃冰箱中保存，待測。

(2)色譜柱條件。色譜柱：Kromasil C18反相色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：0.037 mol·L-1磷酸緩沖液(H3PO4=3.65 g·L-1)-甲醇(90∶10，V/V)；紫外檢測波長：216 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1(見圖1)。

(3)OMA標準曲線的建立。精確稱量OMA標準品2.0 mg，用流動相溶解定容至1 mL，配制濃度為2 mg·mL-1的標準貯備液。精密吸取標準貯備液，梯度稀釋成質(zhì)量濃度為2 000、1 000、500、200、100 mg·mL-1和50 mg·mL-1的標準品溶液。按上述的色譜條件，吸取標準品溶液進樣，每次進樣10 μL，以質(zhì)量濃度為橫坐標(x)，以峰面積為縱坐標(y)進行線性回歸，繪制標準曲線，其回歸方程為：y=794.9x+11713.2，R2=0.9990，表明氧化苦參堿濃度在0.002～2.000 mg·mL-1范圍內(nèi)，峰面積線性關(guān)系良好。

(4)OMA含量測定。精密量取待測樣品制備液10 μL進樣，在相同色譜條件下檢測，根據(jù)標準曲線計算待測樣品OMA含量,其單位為mg·g-1。

1.2.4 苦豆子組培苗中防御酶的活性測定 以不加誘導子的組培苗為對照組，4種內(nèi)生真菌誘導子處理的苦豆子組培苗為處理組，分別測定不同處理組不同誘導天數(shù)的組培苗中PAL、POD、APX、CAT活性，每個處理重復3次。

(1)PAL活性測定。按照PAL測定試劑盒說明書進行操作。參照宛偉國等[14]的方法，按樣本鮮重計算，以每克組織在每mL反應體系中每分鐘使290 nm吸光度變化0.1為一個酶活力單位。

(2)POD活性測定。按POD檢測試劑盒說明書進行操作。參照魏池泉[15]的方法，按照樣本蛋白濃度計算：以每毫克組織蛋白每分鐘催化1 μg底物的酶量為一個酶活力單位。樣本可溶性蛋白含量按照BCA法微量蛋白檢測試劑盒說明書進行測定。

(3)抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定。按APX檢測試劑盒說明書進行操作。參照孫云[16]的方法，按照樣本蛋白濃度計算：以每毫克組織蛋白每分鐘氧化1 μmol抗壞血酸(AsA)的酶量作為一個酶活性單位。樣本可溶性蛋白含量按照BCA法微量蛋白檢測試劑盒說明書進行測定。

(4)過氧化氫酶(CAT)活性測定。按CAT檢測試劑盒說明書進行操作。參照朱小文[17]的提取方法，以每毫克組織蛋白每秒鐘分解1 μmol H2O2的量為一個活力單位。樣本可溶性蛋白含量按照BCA法微量蛋白檢測試劑盒說明書進行測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同內(nèi)生真菌誘導子對苦豆子組培苗OMA含量的影響

由圖2可知，4種內(nèi)生真菌誘導子在不同程度上均能提高苦豆子組培苗中OMA的含量，其中產(chǎn)堿菌株XKYKDF40的誘導效果最好，苦豆子組培苗中OMA含量增加較為明顯，在誘導第15 d達到最高，為3.616 mg·g-1，是對照組第15 d的2.09倍。內(nèi)生真菌誘導子XKZKDF11與誘導子XKYKDF40的誘導趨勢相似，在0～15 d誘導期間OMA含量持續(xù)增長，且始終高于對照，并在第15 d達到最高，是對照組第15 d的1.58倍。誘導子XKZKDF27、NDZKDF13在誘導第3～9 d，組培苗中OMA含量保持增長，在第9 d時OMA含量達到最高，分別為對照組第9 d的1.27和1.95倍，此后隨著培養(yǎng)時間的延長，OMA含量逐漸下降，至誘導結(jié)束NDZKDF13仍高于對照組。

圖1 氧化苦參堿標準品(A)和苦豆子組培苗中氧化苦參堿(B)的HPLC檢測色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of OMA standard (A) and OMA of S. alopecuroides L. tissue culture (B)

圖2 苦豆子內(nèi)生真菌誘導子在不同誘導時間下對宿主OMA含量的影響Fig.2 Effects of endophytic fungal elicitors from S. alopecuroides L.on host OMA at different induction time

2.2 內(nèi)生真菌誘導子對宿主防御酶活性的影響

圖3 內(nèi)生真菌誘導子對苦豆子組培苗PAL活性的影響Fig.3 Effects of endotrophic fungal elicitors on activityof PAL in aseptic seedlings of S. alopecuroides L.

2.2.1 內(nèi)生真菌誘導子對宿主PAL活性的影響 以不同內(nèi)生真菌誘導子處理的苦豆子組培苗為材料，測定不同誘導時間下PAL的活性。如圖3，在4種內(nèi)生真菌誘導子處理初期，苦豆子組培苗中PAL的活性均持續(xù)升高，隨著誘導時間的延長，PAL活性逐漸呈現(xiàn)下降趨勢，但均高于對照組。其中，誘導子XKYKDF40和XKZKDF11激發(fā)PAL活性的作用最好，在誘導處理0～6 d內(nèi)迅速誘發(fā)宿主PAL活性，誘導第6 d達最大值，分別為61.92 U·g-1和58.32 U·g-1，是對照組第6 d的1.42和1.33倍。其次，內(nèi)生真菌誘導子XKZKDF27和NDZKDF13則是在誘導的3～9 d內(nèi)誘發(fā)宿主PAL活性，誘導第9 d達到峰值，分別為56.05 U·g-1和50.80 U·g-1，是對照組第9 d的1.46倍和1.32倍。

2.2.2 內(nèi)生真菌誘導子對宿主POD活性的影響 如圖4所示，4種內(nèi)生真菌誘導子加入后，宿主中POD活性均高于對照組，其中內(nèi)生真菌誘導子XKZKDF27誘導效果最顯著，POD活性始終保持增長，在第12 d達到最大值，為62.30 U·mg-1，是對照組第12 d的2.70倍。誘導子XKZKDF11誘導宿主中POD活性的變化規(guī)律與誘導子XKZKDF27相似，在誘導處理前期POD活性保持增長，第12 d達到最大值，為49.13 U·mg-1，是對照組第12 d的2.13倍。誘導子NDZKDF13和XKYKDF40對宿主POD活性的影響存在小的波動，在第3 d出現(xiàn)第一個小高峰，在誘導第9 d時，誘導子NDZKDF13誘發(fā)宿主中POD的活性達到峰值，為49.79 U·mg-1，是對照組第9 d的2.46倍。而誘導子XKYKDF40處理組在第12 d時POD活性達到最高，為42.46 U·mg-1，是對照組第12 d的1.84倍。

2.2.3 內(nèi)生真菌誘導子對宿主APX活性的影響 如圖5所示，4種內(nèi)生真菌誘導子在誘導處理前期苦豆子組培苗中APX的活性雖高于對照組，但增長緩慢，而在誘導處理中后期宿主APX活性均大幅升高。其中誘導子XKZKDF11的誘導效果最為明顯，在誘導9～12 d時APX活性激增，在第12 d達到峰值，為0.5538 U·mg-1，是各自同時期對照組的4.97倍；其次，誘導子XKYKDF40和XKZKDF27在誘導處理第9 d后，APX活性開始迅速升高，分別于第12 d和15 d達到最高，為0.3948和0.4991 U·mg-1，是同時期對照組的3.54和3.31倍；誘導子NDZKDF13則在誘導6～9 d內(nèi)APX活性激增，在誘導第9 d達到最高，為0.2728 U·mg-1，是同時期對照組的1.34倍。

圖4 內(nèi)生真菌誘導子對苦豆子組培苗POD活性的影響Fig.4 Effects of endotrophic fungal elicitors on activity ofPOD in aseptic seedlings of S. alopecuroides L.

圖5 內(nèi)生真菌誘導子對苦豆子組培苗APX活性的影響Fig.5 Effects of endotrophic fungal elicitors on activity ofAPX in aseptic seedlings of S. alopecuroides L.

2.2.4 內(nèi)生真菌誘導子對宿主CAT活性的影響 由圖6可知，除誘導子NDZKDF13外，其他3種誘導子在誘導處理前期CAT活性皆呈現(xiàn)相對緩慢的增長趨勢，在誘導中后期CAT活性快速升高，之后隨著誘導時間的延長，CAT活性逐步減弱。誘導子XKZKDF11和XKYKDF40在處理0～9 d內(nèi)CAT活性增長緩慢，在9～12 d內(nèi)CAT活性迅速增加，第12 d達到最高，CAT活性分別為19.82、16.87 U·mg-1，是同時期對照組的3.00倍和2.56倍；誘導子XKZKDF27在6～15 d內(nèi)CAT活性快速增長，于第15 d達到最高為10.30 U·mg-1，是同時期對照組的1.47倍；NDZKDF13誘導子在誘導3～9 d內(nèi)CAT活性持續(xù)增長，于第9 d達到最高，CAT活性為14.97 U·mg-1，是同時期對照組的2.47倍。

3 討 論

內(nèi)生真菌誘導子現(xiàn)已廣泛用于提高植物次生代謝產(chǎn)物的合成積累，人們選擇性地利用真菌誘導子促進某種植物中次生代謝物質(zhì)的合成和累積[18]。陶如等[19]通過向白花丹參毛狀根中添加內(nèi)生真菌誘導子，使丹酚酸B和丹參素的產(chǎn)量分別增加1.55倍和2.68倍。本試驗以內(nèi)生真菌菌液濃縮物為誘導子，研究其對宿主OMA含量的影響，發(fā)現(xiàn)4種內(nèi)生真菌誘導子在不同程度上均能提高苦豆子組培苗氧化苦參堿OMA含量，其中產(chǎn)堿菌株XKYKDF40的誘導效果最好，但其余3種誘導子對宿主中OMA含量的誘導效果并不持續(xù)增加，而是在OMA的合成積累量達到某一臨界值后開始下降，其原因可能是：一方面，內(nèi)生真菌誘導子對苦豆子合成OMA的作用受內(nèi)生真菌種類、誘導子時間和濃度等許多因素的影響。不同類型的內(nèi)生真菌誘導子所具備的被宿主細胞受體識別的信息類型及時間先后不同，誘導反應的途徑、速度和強度也不相同，故不同內(nèi)生真菌誘導子表現(xiàn)出的誘導活性有明顯的差異[20]。以同濃度的炭角菌(Xylariasp.)、黑孢霉菌(Nigrosporasp.)和鏈抱菌(Alternariasp.)誘導子分別處理毛葡萄愈傷組織，雖3種真菌誘導子對毛葡萄愈傷組織黃酮含量的積累都有一定程度的促進作用，但炭角菌(Xylariasp.)的誘導效果最好，經(jīng)其處理的愈傷組織中黃酮含量比對照提高了76%[21]。另一方面，植物次生代謝物的合成積累不是無限制的，過多的次生代謝物積累會使植物細胞受到毒害[22]。植物細胞自身通過調(diào)控代謝途徑中關(guān)鍵酶的活性來限制次生代謝物的產(chǎn)量，以維持內(nèi)生真菌與宿主植物之間的拮抗平衡[23]。

圖6 內(nèi)生真菌誘導子對苦豆子組培苗CAT活性的影響Fig.6 Effects of endotrophic fungal elicitors on activity ofCAT in aseptic seedlings of S. alopecuroides L.

PAL是苯丙烷類代謝途徑中的第一個關(guān)鍵酶，也是植物防御反應中重要的標志性酶，參與調(diào)控黃酮類、生物堿類及萜類等次生代謝物的合成，同時，PAL還參與了木質(zhì)素、植保素和植物信號分子水楊酸的合成及多種與植物防御反應相關(guān)代謝物的合成[24]。本試驗中4種內(nèi)生真菌誘導子均能有效激活宿主PAL，在誘導早期使宿主PAL活性明顯提高，表明誘導子觸發(fā)了細胞快速應答。誘導處理后期，PAL活性呈現(xiàn)下降趨勢，可能是由于參與OMA合成的前體物質(zhì)已經(jīng)合成，路徑中的后續(xù)物質(zhì)合成需要其他酶來催化。

活性氧中的H2O2是一種常見植物信號分子，是植物對細胞內(nèi)信號及外界刺激響應的重要調(diào)節(jié)物，參與介導多種代謝反應，但它也可傷害植物細胞，胞內(nèi)高濃度的H2O2可引起細胞膜的氧化及過敏反應，從而引起細胞死亡[25-26]。逆境下植物中H2O2濃度會升高，POD、APX及CAT都是清除活性氧的關(guān)鍵酶，POD還可提高植物抗逆性并促進次生代謝產(chǎn)物的合成[27]，CAT和APX通過將H2O2還原為O2和H2O，以減輕H2O2對植物的傷害，對維持細胞中活性氧的代謝平衡也起著十分關(guān)鍵的作用[28, 29]。陶金華等[30]用內(nèi)生真菌Fusarium SP1處理茅蒼術(shù)懸浮細胞，不僅誘發(fā)了PPO、POD、CAT的活性，還提高了β-桉葉醇的含量。本試驗中4種內(nèi)生真菌誘導子誘導宿主組培苗中POD、CAT和APX活性大幅上升，最后促進宿主OMA的合成，由此說明苦豆子內(nèi)生真菌誘導子可能引起宿主中活性氧的迸發(fā)，宿主細胞對誘導子的刺激迅速做出響應，利用抗氧化酶清除過多的H2O2，減輕活性氧對植物的毒害，從而有利于宿主生物堿的合成積累。

總之，苦豆子內(nèi)生真菌誘導子的加入激發(fā)了苦豆子組培苗的防御性應答反應，繼而提高了宿主中OMA含量。內(nèi)生真菌誘導子誘導植物次生代謝物合成是一個復雜的生物學過程，往往受眾多內(nèi)源信號分子調(diào)控[31]?？喽棺觾?nèi)生真菌誘導子是否通過激活宿主細胞內(nèi)某些特殊的信號轉(zhuǎn)導途徑，誘發(fā)宿主的防御反應并促進生物堿合成，還有待于進一步研究。