賈秀峰，李 波，李 紅，鄔婷婷，馬 赫

(1.齊齊哈爾大學教育與傳媒學院,黑龍江 齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學生命科學與農林學院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室,黑龍江 齊齊哈爾 161006；3.黑龍江省農業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)分院，黑龍江 齊齊哈爾 161005)

誘變育種一般分為物理和化學誘變育種。在物理因素中，輻射通常用于處理植物并誘導突變以培育新品種。因此，物理誘變育種常被稱為輻射誘變育種。輻射誘變技術已經成為生物育種中重要的物理誘變手段，是創(chuàng)造新品種及新種質資源的一條有效途徑，輻射誘變的種類很多，主要有 X 射線、γ 射線、中子、離子束及多種因素結合的空間誘變[1]，由于各種射線電離密度不同，產生生物效應不同，突變率也不同。在輻射誘變中常采用γ射線輻照，而60Co-γ射線又是其中最常用的一種輻射源[2]。利用輻射已成功地獲得了很多早熟、矮化、抗逆、優(yōu)質、育性及其他特異突變體，為基因功能的研究和育種提供了優(yōu)良的種質資源[3]。

輻射育種首先要確定適宜的誘變劑量才能獲得有效的誘變效果，而誘變劑量是按照材料對輻射敏感程度來確定的。在一定劑量的輻射作用下，生物體組織的形態(tài)和功能及細胞內含物會發(fā)生相應變化，它是評價植物對輻射反應的重要指標，也是確定誘變劑量以及處理方法的依據(jù)。針對特定的品種，需通過試驗重新確定其適宜的輻射劑量，研究人員先后對狗牙根[4]、扁穗牛鞭草[5]、高羊茅[6]和無芒雀麥[7]等重要的牧草進行60Co-γ射線輻射的種子萌發(fā)和幼苗生長影響的研究，并確定其最適輻射劑量。近年來，利用 γ射線輻射誘變了許多牧草種類, 如沙打旺、蘇丹草、苜蓿、黑麥草等, 育成了新牧1號紫花苜蓿 、超早熟沙打旺、多花黑麥草等牧草新品種和新材料，為我國草業(yè)發(fā)展做出了卓越貢獻[8]。

谷稗(Echinochloacrusgalli)是一種一年生的禾本科牧草，其適應性較強，生長快，是一種產量高、適口性好的優(yōu)良飼料[9]。在鹽堿及干旱條件下也可生長，其干草、籽實的粗蛋白、粗脂肪及維生素均高于其他禾谷類植物，對畜牧業(yè)發(fā)展有著重要的應用價值，但對其種質資源更新的研究甚少，導致谷稗品種單一。本研究探討不同60Co-γ射線輻照劑量對谷稗種子萌發(fā)及芽苗生長特性的影響，為谷稗的人工誘變育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以黑龍江畜牧研究所提供的60Co-γ不同輻射劑量的谷稗(朝牧1號)干種子為材料。

1.2 試驗方法

1.2.160Co-γ射線輻照處理谷稗種子 以中國農業(yè)科學院原子能利用研究所的60Co-γ射線為輻射源，于2016年5月進行谷稗干種子輻射處理，強度分為低劑量(50、100、150 Gy)；中劑量(200、250、300 Gy)；高劑量(350、400、450 Gy)，劑量率15 Gy·min-1，每個處理100 g種子，以同批未輻照的種子為對照。

1.2.2 谷稗種子發(fā)芽試驗 選取輻射處理和對照的種子各150粒，用35℃蒸餾水浸泡2 h，置入鋪有2層濾紙的發(fā)芽盒中，25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，以胚芽長度大于2 mm即視為發(fā)芽，以3 d發(fā)芽種子數(shù)計算發(fā)芽勢，以7 d發(fā)芽種子數(shù)計算發(fā)芽率。取7 d芽苗20株，用游標卡尺測量其芽長、根長和芽苗總長度。選取芽苗10株，測其鮮重，80℃烘箱烘干后測其干重。各指標均重復3次。

發(fā)芽率GR(%)=第7 d發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽勢GE(%)=3 d內發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%；發(fā)芽指數(shù)GI=∑Gt/Dt(Gt指時間t的發(fā)芽數(shù)，Dt指相應的發(fā)芽天數(shù))；活力指數(shù)VI=S×∑Gt/Dt(S指芽苗的根長)；相對含水量=(第7 d芽苗重量-烘干后芽苗重量)/第7 d芽苗重量×100%。

1.2.3 出苗率與成苗率調查 選取輻射處理和對照的種子各45粒，用35℃蒸餾水浸泡2 h，播于裝有2∶1的營養(yǎng)土與珍珠巖混合育苗缽中，置于溫室。播后7 d統(tǒng)計種子的出苗率，21 d統(tǒng)計幼苗的存活率即為種子的成苗率，重復測定3次。

出苗率(%)=出苗數(shù)/播種種子總數(shù)×100%

成苗率(%)=成苗數(shù)/播種種子總數(shù)×100%

1.2.4 數(shù)據(jù)的分析處理 圖表繪制使用Excel 2010軟件，利用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)差異顯著性和相關性分析。

2 結果與分析

2.1 輻照處理對谷稗種子萌發(fā)的影響

由表1可見，60Co-γ射線輻射處理后，種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)隨著輻射劑量的增加呈先增后降的趨勢，而活力指數(shù)則隨著輻射劑量增加而降低。低輻射劑量后谷稗種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)均高于對照組，而中高輻射劑量明顯降低了谷稗種子的發(fā)芽率和活力指數(shù)，但卻提高了谷稗種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)。

谷稗種子發(fā)芽率比較低，50～150 Gy低輻射劑量提高種子發(fā)芽率，輻射劑量為150 Gy時發(fā)芽率達最大值，但與對照組比較差異不顯著(P>0.05)，300～450 Gy輻射劑量下，種子的發(fā)芽率均低于70%；50～450 Gy輻射劑量下種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)均高于對照組，而活力指數(shù)均低于對照組，在250 Gy和350 Gy輻射劑量時發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)分別達到最大值，450 Gy輻射劑量時活力指數(shù)達到最小值，高輻射劑量對種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)影響極大(P<0.05)，說明輻射處理影響谷稗種子發(fā)芽的整齊度和生命力。

2.2 輻照處理對谷稗種子芽苗生長特性的影響

60Co-γ射線輻射處理后對谷稗種子芽苗的總長、主根長和芽長的影響隨輻射劑量增加而減少(表2)，低劑量輻射對芽苗的生長影響較小，而中高輻射劑量對芽苗的生長影響較大，400 Gy和450 Gy時芽長比對照下降了50%以上，350、400、450 Gy的高劑量下主根長和芽苗總長分別比對照下降了60%和50%以上，450 Gy輻射劑量下芽苗生長的抑制作用最強，中高輻射劑量對谷稗芽苗生長帶來了一定的不利影響，輻射使谷稗芽苗出現(xiàn)了一定程度的矮化。輻射組與對照相比芽苗的總長、主根長和芽長差異顯著(P<0.05)。

2.3 輻照處理對谷稗芽苗生物量和相對含水量的影響

60Co-γ射線輻射種子的芽苗鮮重、干重和相對含水量隨輻射劑量增加呈先增后降的趨勢(表2)，不同輻射劑量對芽苗鮮重、干重和相對含水量的影響程度不同。低輻射劑量除50 Gy外對鮮重的影響不大，150 Gy的鮮重比對照增加了8.80%，但差異不顯著(P>0.05)，300～450Gy輻射組對芽苗鮮重影響較大，均較對照組下降30%以上，除100 Gy和150 Gy輻射劑量外，其它輻射劑量和對照的芽苗鮮重差異顯著(P<0.05)；芽苗干重均低于對照，50～450 Gy輻射組與對照相比芽苗干重降低了2.91%～11.58%，輻射組與對照比較差異顯著(P<0.05)；不同輻射劑量促進芽苗相對含水量的增加，50～450 Gy輻射劑量比對照的相對含水量增加了29.37%～57.54%。輻射對幼苗相對含水量影響較大(P<0.05)。

2.4 輻照處理對谷稗種子出苗率和幼苗成苗率的影響

種子出苗率和幼苗成苗率均隨輻射劑量的增加呈先增后減的趨勢(表3)，中低輻射劑量對種子出苗率有一定的促進作用，高輻射劑量中450 Gy體現(xiàn)為抑制作用。低輻射劑量對幼苗成苗率影響不大，中高輻射劑量則體現(xiàn)出極高的抑制作用，甚至高輻射劑量使谷稗幼苗無法成苗。

表1 輻照處理對谷稗種子萌發(fā)特性的影響

注:同列不同小寫字母表示處理間顯著差異(P<0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference among treatment (P<0.05), the same below.

表2 輻照處理對谷稗種子芽苗生長特性的影響

表3 輻照處理對谷稗出苗率和成苗率的影響

2.5 輻照處理后谷稗種子萌發(fā)相關指標的相關性分析和主成分分析

不同劑量的60Co-γ射線輻射后谷稗種子萌發(fā)指標的相關性分析見表4。經60Co-γ射線輻射后，發(fā)芽率、活力指數(shù)、芽長、主根長、芽苗總長、鮮重均與成苗率呈極顯著正相關，相關系數(shù)分別為0.933、0.874、0.958、0.894、0.936和0.802，干重與成苗率呈顯著相關，相關系數(shù)為0.754，發(fā)芽勢和發(fā)芽指數(shù)與成苗率呈極顯著負相關，相關系數(shù)分別為-0.854和-0.853，為了進一步了解60Co-γ射線輻射對谷稗種子萌發(fā)期各指標的關系，對其進行主成分分析。

60Co-γ輻射后谷稗種子萌發(fā)相關指標的主成分分析特征值和貢獻率見表5，60Co-γ輻射后谷稗萌發(fā)性狀主成分分析矩陣見表6，在所測定的12個萌發(fā)相關指標中，前2個主成分的累計貢獻率為85.736%，特征值總和為10.289。通過對10個輻射劑量12個相關指標的計算，獲得了各指標對綜合性狀貢獻大小的特征向量(表6)。通過各萌發(fā)性狀在主成分中系數(shù)的大小，確定了其在萌發(fā)過程中的作用以及方向。同時各主成分之間彼此獨立，它們分別來自不同的萌發(fā)指標。

表4 輻照處理后谷稗種子萌發(fā)相關性狀的相關系數(shù)矩陣

注：X1～X12分別為發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)、芽長、主根長、芽苗總長、鮮重、干重、相對含水量、出苗率和成苗率。*為P<0.05水平顯著相關，**為P<0.01水平極顯著相關。下同。

Note:X1～X12are germination rate, germination potential, germination index, vigor index, bud length, main root length, total length of bud seedling, fresh weight, dry weight, relative water content, germination rate and survival rate, respectively. * is significantly correlated withP<0.05 level, ** is significantly correlated withP<0.01 level. The same below.

由表6可知，第一主成分Y1中，芽長、芽苗總長和主根長具有較大的正系數(shù)值，其中以芽長度的荷載值最大，芽苗總長和主根長的荷載值次之，而發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢和相對含水量則具有較大的負系數(shù)值，表明第一主成分主要反映了芽長、芽苗總長和主根長等形態(tài)數(shù)據(jù)，描述了芽苗的生長指標特性。

第二主成分Y2中，相對含水量、出苗率、發(fā)芽率和鮮重具有較大的正系數(shù)值，其中以相對含水量的荷載值最大，出苗率和鮮重次之，而活力指數(shù)和芽苗長度則具有較大的負系數(shù)值，第二主成分升高時，相對含水量、出苗率、發(fā)芽率和鮮重必然增加，而芽苗長度和活力指數(shù)則會降低，因此第二主成分可以看作是以出苗率、發(fā)芽率為主的早期萌發(fā)指標特性。

依據(jù)主成分的方差貢獻率和主成分的原性狀相關矩陣值計算出特征向量，特征向量大于0.3的作為60Co-γ射線輻照影響谷稗萌發(fā)特性的主要指標，它們分別為芽長、芽苗總長、主根長、成苗率、活力指數(shù)、發(fā)芽率、相對含水量和出苗率。

表5 輻照處理后谷稗種子萌發(fā)指標主成分分析的特征值和貢獻率

表6 輻照處理谷稗種子萌發(fā)性狀主成分矩陣和特征向量

3 討 論

關于輻射誘變，其關鍵點在于找到合適的輻射劑量，根據(jù)韓貴清、劉軍麗等[9-10]的相關研究，在一定范圍內增加輻射劑量可以拓寬突變譜，但過高的輻射劑量會降低出芽率、增加畸變率。不同種類的植物對于輻射的敏感度不同導致適宜劑量也不同[10]。在經過輻射處理后，谷稗種子的發(fā)芽率和發(fā)芽勢出現(xiàn)了先增加后減小的趨勢，這與韓貴清等[9]所提出的谷稗種子在經過60Co-γ射線輻照后，隨著輻射劑量的增大谷稗種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢逐漸降低的結論不同，其原因在于其研究的是超低劑量的輻射對谷稗種子的影響，我們擴大了輻照范圍后發(fā)現(xiàn)低劑量的輻射是對谷稗種子發(fā)芽有促進作用的，這與王月華等[11]對早熟禾的研究結果一致。隨著輻射劑量的增大，輻射能量積累量越來越多，導致谷稗活力指數(shù)出現(xiàn)了隨輻射劑量增加而降低的趨勢，這與耿興敏等[12]研究60Co-γ輻射對桂花種子萌發(fā)的影響的結果一致。

隨著輻射劑量的增加，對谷稗種子芽苗生長也產生了明顯的抑制作用，導致種子芽苗的根長和芽長顯著降低，生物量也出現(xiàn)降低的趨勢，原因可能與60Co-γ射線輻照過程中破壞了部分種胚有關，因為種胚受損就會導致細胞生長和增殖受阻，自然會對芽苗生長產生影響，這與耿興敏等[12]對桂花種子芽苗和蔡春菊等[13]研究毛竹種子幼苗的結果一致。

輻射能量的堆積也可能導致芽尖分生區(qū)細胞分裂產生抑制作用，且會隨著芽苗生長而不斷體現(xiàn)出來，最終導致幼苗難以生長，甚至不能成苗[14]。試驗發(fā)現(xiàn)，雖然中高輻射劑量種子可以正常出苗，但一周后芽苗出現(xiàn)了大量死亡，具體表現(xiàn)為從芽尖開始自上而下的萎蔫直至死亡，這種中高劑量的輻射對谷稗芽尖的影響最終導致其出苗率和成苗率不一致。

輻射育種首先要確定適宜的誘變劑量才能獲得有效的誘變，而誘變劑量是按照材料的輻射敏感性來確定的。Xu等[15]1998年報道，目前已知的禾本科作物適宜誘變劑量為：燕麥種子半致死劑量在200～350 Gy之間，黑麥、高粱、小黑麥種子半致死劑量在200～300 Gy之間。但韓貴清等[9]研究中使用超低劑量的γ射線輻射,御谷和谷稗幼苗高度不同程度地高于對照。本研究參照前人試驗確定了初步輻射范圍為50～450 Gy，每50 Gy為一個輻射劑量共計9個試驗組。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，雖然輻射劑量的增加使得發(fā)芽勢有所增加，但是7 d時發(fā)芽率出現(xiàn)了明顯的先增后減的趨勢，且活力指數(shù)出現(xiàn)明顯的下降。且在7 d時芽苗長度及根長也隨輻射劑量的增加而減小。除450 Gy組外，7 d時出苗率雖均有所增高，但21 d成苗率表現(xiàn)出了極其強烈的抑制作用，300～450 Gy輻射組導致谷稗種子幼苗無法成苗。

輻射對種子萌發(fā)和幼苗生長的影響是由多種因素相互作用而構成的較為復雜的體系, 用單一指標很難準確分析輻射的影響[16], 必須對多個指標運用相關性分析法、主成分分析法、矩陣分析法等進行綜合分析[17], 真實地評價60Co-γ射線輻射誘變處理對不同性狀因子的影響。通過主成分分析法，采用發(fā)芽率、成活率等共12個測量指標，對輻射劑量處理谷稗種子誘變效應進行綜合評價，表明影響谷稗誘變效應的主導因子為芽長、芽苗總長、主根長、成苗率、活力指數(shù)、發(fā)芽率、相對含水量和出苗率。綜合考慮各主成分的重要程度、生長特性指標和早期萌發(fā)指標，初步認為低輻射劑量可以很好地反映60Co-γ射線對谷稗的誘變效應。

不同輻射劑量對谷稗種子的萌發(fā)、芽苗生長和種子出苗率及幼苗成苗率產生了不同的影響。低輻射劑量可促進種子萌發(fā)，中高輻射劑量由于輻射的作用導致多項萌發(fā)特性指標顯著下降，甚至使谷稗幼苗無法成苗。綜合分析50～150 Gy低輻射劑量對谷稗種子有良好的誘變效果。