潘吉脈,張明洋,賀欣微,胡安東,楊 霞,張 飄,姜海波,文 明,2

(1.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,貴州 貴陽(yáng) 550025;2.貴州省動(dòng)物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州 貴陽(yáng) 550025)

我國(guó)是鱘魚(yú)養(yǎng)殖規(guī)?；^大的國(guó)家,主要養(yǎng)殖品種為施氏鱘、西伯利亞鱘、匙吻鱘、雜交鱘等,其中雜交鱘是由不同品種的鱘魚(yú)利用雜交技術(shù)孕育而來(lái),具有生長(zhǎng)快、性成熟早、遺傳性狀穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)效益高等優(yōu)勢(shì);因此,在鱘魚(yú)養(yǎng)殖量中占比相當(dāng)高的份額[1]。但在養(yǎng)殖雜交鱘的過(guò)程中,由于其易暴發(fā)疾病,尤以細(xì)菌性疾病較為嚴(yán)重,給鱘養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成嚴(yán)重阻礙。

維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)隸屬弧菌科、氣單胞菌屬,廣泛存在于淡水環(huán)境：河流、湖泊、污水以及淤泥中,可引起多種水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病。曾有鯽、鯉、鰻、蝦、蟹等水生動(dòng)物感染發(fā)病,主要臨床癥狀為腹腔積水,表皮出血,肛腸潤(rùn)紅等[2],其死亡率高達(dá)80%左右,給養(yǎng)殖行業(yè)帶來(lái)重大經(jīng)濟(jì)損失。曾有報(bào)道從患病西伯利亞鱘中分離鑒定出維氏氣單胞菌,但雜交鱘感染維氏氣單胞菌報(bào)道較少。本試驗(yàn)從貴州某魚(yú)場(chǎng)獲得患病雜交鱘,主要癥狀為體表出血、肛門(mén)紅腫外翻、魚(yú)鰓暗紅,剖檢出現(xiàn)腹中嚴(yán)重積水、肝臟腫大等,初步疑似細(xì)菌性疾病,從患病雜交鱘中分離出一優(yōu)勢(shì)菌株,經(jīng)染色鏡檢、生化鑒定、細(xì)菌16S rDNA基因分析,并進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析與序列比對(duì),K-B法藥敏試驗(yàn)及耐藥基因與毒力基因檢測(cè),此試驗(yàn)對(duì)貴州地區(qū)鱘細(xì)菌性疾病的防治和合理用藥指導(dǎo)提供理論參考,以及提高經(jīng)濟(jì)效益做出貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基(BHI)與液體培養(yǎng)基均由貴州大學(xué)動(dòng)物疫病研究所獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室自制;革蘭染色試劑盒,購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;細(xì)菌生化鑒定管和細(xì)菌藥敏紙片,均購(gòu)自擎科生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒,購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司;健康狀況良好的昆明種小鼠10只,購(gòu)自重慶騰鑫生物科技有限公司。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng) 患魚(yú)由貴州省某水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)運(yùn)送至本實(shí)驗(yàn)室,用75%酒精擦拭患魚(yú)全身,以作魚(yú)體表面消毒處理,無(wú)菌操作條件下,取患魚(yú)心、肝、腎、脾、腹水劃線接菌于 BHI,置于30℃,24 h恒溫箱中培養(yǎng),細(xì)菌長(zhǎng)出。取其優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)一步純化培養(yǎng)。同時(shí)也進(jìn)行革蘭染色,顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.3 細(xì)菌生化鑒定 挑取單個(gè)菌落接種于BHI液體培養(yǎng)基中,純化培養(yǎng)后,用接菌棒沾取菌液,插入細(xì)菌微量生化管中,后將微量生化管置于30℃恒溫箱,培養(yǎng)24 h。生化的測(cè)定指標(biāo)參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手則》,并用黎炯等[3],楊移斌等[4]人方法,對(duì)分離菌進(jìn)行初步鑒定。

1.4 分離菌16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序及序列分析 以提取分離株DNA為模版,細(xì)菌16S rDNA通用引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,上、下游引物分別是：27F：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′,1492R： 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′;預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為1 500 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μL,2 ×TaqPCR Markter Mix：12.5 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,剩下用雙蒸水補(bǔ)足。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,55℃退火溫度45 s,72℃延伸90 s,共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。取10 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果。

另送PCR產(chǎn)物于生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行基因序列測(cè)序;測(cè)序結(jié)果與NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行對(duì)比分析;利用Mega 7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。通過(guò)自薦分析進(jìn)行置信度檢測(cè),自薦數(shù)集1 000次。

1.5 分離菌動(dòng)物試驗(yàn) 將分離菌接種于HBI液體培養(yǎng)基中,30℃溫箱培養(yǎng)10 h,將菌液離心,收集菌體,用滅菌PBS洗滌菌體兩次,并把菌體配備成1×108CFU/mL濃度的菌懸液。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為10只健康小鼠,隨機(jī)分為試驗(yàn)組與對(duì)照組各5只;試驗(yàn)組小鼠腹腔注射100 μL濃度為1×108CFU/mL菌懸液,對(duì)照組注射無(wú)菌PBS;連續(xù)觀察7 d,對(duì)小鼠出現(xiàn)臨床癥狀進(jìn)行記錄,并對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢及病原菌分離,生化鑒定死亡小鼠分離出的病原菌。

1.6 分離菌藥敏試驗(yàn) 藥敏試驗(yàn)用全國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)委推薦的K-B法,進(jìn)行測(cè)定分離菌對(duì)藥物的敏感程度,純化培養(yǎng)后的菌液,吸取100 μL涂勻于HBI固體培養(yǎng)基上,后將藥敏紙片規(guī)則的放在BHI培養(yǎng)基上,每個(gè)培養(yǎng)基上放5片藥敏紙片,于30℃培養(yǎng)24 h后,用游標(biāo)卡尺測(cè)定抑菌圈。結(jié)果判定依據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)研究所出版《藥敏試驗(yàn)指南》的標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行證實(shí)菌株對(duì)不同抗生素藥物的敏感程度。

1.7 分離菌耐藥性基因與毒力基因檢測(cè) 以分離菌提取的DNA為模板,對(duì)耐磺胺基因(Sul1,Sul2)、Ⅰ類(lèi)整合子(Intl1)、耐藥氟苯尼考基因(FxeA)4種耐藥基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增,引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[5-7],引物由生工生物工程(上海)股份有限公司承接合成,耐藥基于引物信息見(jiàn)表1;反應(yīng)體系同1.4,反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s,退火(退火溫度見(jiàn)表1)45 s,72℃延伸45 s,共35個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min;PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

表1 耐藥基因檢測(cè)引物信息

運(yùn)用PCR法檢測(cè)分離菌部分毒力基因,參照朱成科等[8]所示的毒力基因,它們分別為氣溶素(Aer)、溶血素(Hly)、黏附素(Aha)、外膜蛋白(OmpA)4種毒力基因。以分離菌DNA為模板,設(shè)計(jì)引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物信息見(jiàn)表2;反應(yīng)體系與條件同1.4;PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠檢測(cè)結(jié)果。

表2 毒力基因檢測(cè)引物信息

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 從外觀為魚(yú)鰓暗紅、體表出血點(diǎn)、肛門(mén)紅腫外翻和剖檢出現(xiàn)肝臟腫大,腹中積水嚴(yán)重的雜交鱘中,分離細(xì)菌接種在BHI培養(yǎng)基,置于30℃培養(yǎng)24 h,分離得一優(yōu)勢(shì)菌株,觀察出現(xiàn)邊緣整齊、中間隆起、表面濕潤(rùn)、乳白色透明的菌落,用血平板培養(yǎng)基培養(yǎng),該菌菌落出現(xiàn)β溶血圈(見(jiàn)中插彩版圖1中A);經(jīng)革蘭染色,鏡檢觀察所見(jiàn)：該菌為革蘭陰性菌,菌體形態(tài)為兩端鈍圓的短桿菌(見(jiàn)中插彩版圖1中B)。

圖1 細(xì)菌血平板培養(yǎng)和革蘭染色圖

2.2 分離菌生化鑒定 分離菌生化鑒定結(jié)果見(jiàn)表3,分離菌鑒定結(jié)果結(jié)合革蘭染色和細(xì)菌形態(tài)特征,參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》初步將分離菌鑒定為維氏氣單胞菌。

2.3 分離菌16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序以及系列分析結(jié)果以分離菌DNA為模板,用設(shè)計(jì)的16S rDNA通用引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),得1 500 bp左右的基因條帶,與預(yù)計(jì)擴(kuò)增條帶一致;用PCR產(chǎn)物16S rDNA進(jìn)行測(cè)序,得序列長(zhǎng)度為1 477 bp,提交該序列于GenBank,并對(duì)此序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析;結(jié)果顯示,分離菌的16S rDNA序列與GenBank中的A.Veronii序列相似度達(dá)99.00%(見(jiàn)圖2);用Gema7.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),發(fā)現(xiàn)分離菌與多株維氏氣單胞菌聚在同一進(jìn)化分支上;綜合分離菌形態(tài)特征與生化結(jié)果,可確定該分離菌為維氏氣單胞菌。

表3 分離菌生化鑒定

圖2 分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 分離菌動(dòng)物回歸試驗(yàn) 注射菌懸液后的試驗(yàn)組小鼠,初見(jiàn)小鼠離群?jiǎn)未?觀察7 d,試驗(yàn)組在48 h后開(kāi)始出現(xiàn)小鼠死亡,到第7天時(shí)試驗(yàn)組小鼠死亡4只,致死率達(dá)80%;對(duì)照組小鼠無(wú)明顯變化。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢,發(fā)現(xiàn)肝臟腫大,腹腔積液,這些現(xiàn)象是維氏氣單胞菌引起的典型病變,后從死亡小鼠體內(nèi)分離出菌株,經(jīng)生化鑒定與分離菌生化指標(biāo)變化相符,動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明該菌株有較強(qiáng)致病性。

2.5 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 選用14種常用抗生素藥物對(duì)分離菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果如表4,分離菌對(duì)環(huán)丙沙星、對(duì)氟苯尼考、頭孢哌酮、新霉素4種抗生素有較高的敏感;對(duì)多粘菌素B、哌拉西林、克林霉素、羧芐西林、紅霉素有中度敏感程度;剩余抗生素藥物表現(xiàn)出耐藥。

2.6 分離菌耐藥性基因與毒力基因檢測(cè)結(jié)果PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)耐藥基因,檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3,耐藥基因陽(yáng)性條帶有耐磺胺基因兩條(Sul1,Sul2),Ⅰ類(lèi)整合子(Intl1)基因一條,未見(jiàn)擴(kuò)增出氟苯尼考耐藥基因(FxeA)條帶,所出現(xiàn)陽(yáng)性基因條帶大小與預(yù)測(cè)出現(xiàn)基因條帶大小相符,分離菌含有耐藥基因Sul1(163 bp)、Sul2(191 bp)、Intl1(146 bp)3種耐藥基因。

表4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

圖3 耐藥性基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖

通過(guò)PCR檢測(cè)致病性基因,結(jié)果顯示,該株毒力基因陽(yáng)性條帶為氣溶素(Aer)和粘附素(Aha)兩種基因,出現(xiàn)基因條帶大小結(jié)果與預(yù)測(cè)基因條帶大小一致;未檢出溶血素(HIy)與外膜蛋白(OmpA)毒力基因;結(jié)果見(jiàn)圖4,得出分離菌含有Aer(417 bp)和Aha(998 bp)毒力基因。

3 討論

1983 年維氏氣單胞菌首次被法國(guó)微生物學(xué)家發(fā)現(xiàn),它的發(fā)現(xiàn)是從溺水身亡者的呼吸道分泌物中分離得到[9],我國(guó)首次報(bào)道分離出維氏氣單胞菌,由崔樹(shù)玉等[10]在1989年從黑魚(yú)中分離鑒定發(fā)現(xiàn)該菌,后續(xù)中,相續(xù)報(bào)道維氏氣單胞菌引起中華絨螯蟹、斑點(diǎn)叉尾鮰、鰻鱺、西伯利亞鱘等水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病[11-13],可見(jiàn)維氏氣單胞菌能夠引起多種水生動(dòng)物發(fā)病。前人已有報(bào)道西伯利亞鱘感染維氏氣單胞菌發(fā)病的病例,并有魚(yú)鰓發(fā)白的癥狀,本試驗(yàn)從發(fā)病雜交鱘中分離出維氏氣單胞菌病原,發(fā)病占未見(jiàn)魚(yú)鰓發(fā)白顯現(xiàn);這一點(diǎn)能說(shuō)明：維氏氣單胞菌引起同種間不同品系的水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病,但出現(xiàn)的癥狀不盡相同,這可能是品系、水生環(huán)境、菌株間差異的不同,而出現(xiàn)的結(jié)果。

圖4 毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果圖

關(guān)于耐藥基因的檢測(cè)：磺胺類(lèi)藥物在水產(chǎn)動(dòng)物養(yǎng)殖中,是廣譜抗生素,具有抑菌效果好的特點(diǎn),所以在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛的推廣使用,而濫用容易出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象。I類(lèi)整合子可存在質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子等移動(dòng)基因原件上,細(xì)菌之間移動(dòng)基因之間的交接轉(zhuǎn)換,是細(xì)菌獲得多重耐藥性的重要原因;耐磺胺類(lèi)藥物的抗性形成,跟Ⅰ類(lèi)整合子有很密切的關(guān)系[14],藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,分離菌出現(xiàn)耐磺胺類(lèi)藥物,可能是分離菌攜帶Sul1、Sul2、Intl1三種耐藥基因,與本地養(yǎng)殖戶應(yīng)用磺胺類(lèi)藥物不當(dāng)?shù)脑颉?/p>

維氏氣單胞菌的致病性與其所攜帶的毒力基因存在很大的關(guān)系。氣溶素(Aer)具有溶血性、細(xì)胞毒性、腸毒性等特點(diǎn),是引起β溶血現(xiàn)象的毒力基因,它具有破壞細(xì)胞膜的通透性,引起多種內(nèi)臟與體表廣泛性出血的功能;又是維氏氣單胞菌主要毒力因子之一[15]。血溶素(HIy)毒力因子具有能溶細(xì)胞活性,誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的生物學(xué)功能[16]。膜蛋白(OmpA)毒力因子具有抗吞噬,抗補(bǔ)體的作用,這很有利于維氏氣單胞菌逃避機(jī)體免疫清除[17]。粘附素(Aha)毒力因子在維氏氣單胞菌感染中起到吸附定植于動(dòng)物機(jī)體細(xì)胞上的作用,有觀點(diǎn)稱(chēng)Aha毒力因子是引起體表潰爛的原因之一[18]。本試驗(yàn)檢測(cè)Aer、HIy、OmpA和 Aha四種毒力基因,對(duì)分離菌進(jìn)行毒力基因檢測(cè),結(jié)果顯示,分離株攜帶Aer、Aha兩種毒力基因?；疾‰s交鱘中出現(xiàn)體表出血、肛門(mén)紅腫外翻的癥狀和培養(yǎng)于血平板上出現(xiàn)β溶血現(xiàn)象,可能是分離株攜帶Aer毒力基因引起的。分離菌攜帶Aha毒力基因,而通過(guò)觀察未見(jiàn)患鱘體表潰爛的癥狀,出現(xiàn)這種結(jié)果,可能是基因的表達(dá)受多種因素制約。雜交鱘還出現(xiàn)嚴(yán)重腹水的癥狀,但未見(jiàn)資料表明由某個(gè)特定毒力基因誘發(fā);這種現(xiàn)象,可能是分離菌致病性是多種毒力因子共同協(xié)調(diào)作用的結(jié)果。

關(guān)于藥敏試驗(yàn)：在此試驗(yàn)前已有多人對(duì)維氏氣單胞菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),曹恒源[19]等對(duì)圓口銅魚(yú)維氏氣單胞菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,圓口銅魚(yú)維氏氣單胞菌對(duì)四環(huán)素、氟苯尼考、諾佛沙星等藥物敏感,胡天野[20]等框鏡鯉維氏氣單胞菌藥敏研究結(jié)果顯示,框鏡鯉維氏氣單胞菌對(duì)四環(huán)素,慶大霉素,青霉素有較高的抑菌效果;本試驗(yàn)藥敏結(jié)果顯示,分離菌對(duì)環(huán)丙沙星、氟苯尼考、頭孢哌酮、新霉素4種抗生素敏感,對(duì)磺胺異惡唑、四環(huán)素、苯唑西林3種藥物耐受;本試驗(yàn)藥敏結(jié)果分離菌對(duì)四環(huán)素耐受,與曹恒源、胡天野藥敏報(bào)道的結(jié)果不一致,這可能跟養(yǎng)殖品種、養(yǎng)殖環(huán)境、及養(yǎng)殖方式的不同而見(jiàn)的結(jié)果;故今后在此病的防治過(guò)程中,最好從患病水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)分離菌株,并進(jìn)行藥敏試驗(yàn),根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果,結(jié)合藥物吸收特性,選擇敏感高與吸收率強(qiáng)的藥物進(jìn)行安全給藥。