張 鐵，楊永超，孔 鑫

（1.文山學(xué)院 科研與成果轉(zhuǎn)化中心，云南 文山 663099；2.文山州生物資源開發(fā)研究中心，云南 文山 663099；3.文山州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，云南 文山 663099；4.文山學(xué)院 環(huán)境與資源學(xué)院，云南 文山 663099）

滇黃精（Polygonatum kingianumColl.et Hemsl.）為百合科黃精屬多年生草本植物，又名節(jié)節(jié)高、仙人飯，主要分布在云南、廣西等地[1]。滇黃精以根莖入藥，除含有黃精多糖、甾體皂苷、類黃酮等活性物質(zhì)外，還含有生物堿、木脂素類化合物、蒽醌類化合物及多種人體必需的氨基酸和微量元素[2]，具有免疫激發(fā)、免疫促進、抗輻射、抗腫瘤、抗衰老、降血糖、降血脂、抗疲勞、耐缺氧等作用，在臨床上用于治療糖尿病、冠心病、高脂血癥、肺結(jié)核、淋巴結(jié)核、白細(xì)胞減少、腹瀉、便秘、失眠等多種癥病[3]，具有較高的保健及藥用價值。近年來，隨著市場需求增加，對野生黃精資源產(chǎn)生了巨大壓力，故黃精人工栽培對滿足市場需求，緩解野生黃精生存壓力及保持野生黃精種質(zhì)資源的多樣性具有重大意義。

黃精可用種子和營養(yǎng)器官進行繁殖，但種子繁殖時出苗率低、苗期長，而用塊莖繁殖則繁殖系數(shù)低[4]，長期使用塊莖無性繁殖還會面臨種性退化的風(fēng)險，故這兩種方法均不利于黃精規(guī)?；N植。組織培養(yǎng)技術(shù)能高效地提供優(yōu)質(zhì)種苗，可有效解決滇黃精規(guī)模種植中種苗的問題。滇黃精的根狀莖、葉、花藥[5]、根莖嫩芽[6]、種子[7]均可作為外植體，而對增殖培養(yǎng)和生根培養(yǎng)的研究報道較少，增殖系數(shù)及生根系數(shù)均不甚理想。

本研究以愈傷組織誘導(dǎo)的不定芽為材料，采用正交試驗的方法對增殖培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基進行優(yōu)化，以提高增殖及生根效率，為滇黃精種苗快速繁育提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用滇黃精愈傷組織誘導(dǎo)的不定芽由文山學(xué)院生物資源開發(fā)研究中心實驗室提供。選用同一批次、長勢良好、大小近似的滇黃精不定芽為材料。

1.2 試驗方法

1.2.1 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

以MS為基本培養(yǎng)基，6-BA、KT、多效唑的質(zhì)量濃度設(shè)置見表1，試驗采用L9（34）正交設(shè)計。選取優(yōu)質(zhì)的叢生芽，在超凈工作臺中切為大小相仿的叢生芽塊接種在不同激素濃度配比的MS培養(yǎng)基上進行增殖，每瓶接種3個莖段，每處理接種10瓶，50 d后統(tǒng)計不定芽的增殖情況。增殖系數(shù)=芽的平均數(shù)/接種數(shù)×100%，平均增殖數(shù)=增殖芽數(shù)/接種芽數(shù)。

表1 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗因素水平表

1.2.2 生根培養(yǎng)基優(yōu)化

生根培養(yǎng)基以MS、NAA和IBA濃度為因素，試驗采用L9（34）正交設(shè)計，其濃度設(shè)置見表2，每個處理接種10瓶，每瓶3個莖段。40 d后取出組培苗，洗凈培養(yǎng)基測量每瓶中每叢的生根數(shù)及根長。生根系數(shù)=生根總數(shù)/接種數(shù)×100%，生根率=生根苗數(shù)/接種苗數(shù)×100%。

表2 生根培養(yǎng)基優(yōu)化正交試驗因素水平表

1.2.3 培養(yǎng)條件

不同處理的培養(yǎng)基蔗糖濃度為30 g/L，瓊脂粉5.8 g/L，PH調(diào)至5.8。培養(yǎng)溫度為（25±1）℃，光照強度2 500 Lx，光照時間12 h/d。

1.2.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS10.0進行相關(guān)數(shù)據(jù)處理及方差分析。

2 結(jié)果

2.1 增殖培養(yǎng)基優(yōu)化

培養(yǎng)10 d左右，滇黃精開始有芽出現(xiàn)，隨后芽的數(shù)量進一步增多，并逐漸伸長，50 d后統(tǒng)計各處理的增殖情況，其結(jié)果見圖1和表3。

直觀分析表明，影響滇黃精增殖系數(shù)的因素主次順序為 B（6-BA）＞C（PP333）＞A（KT），培養(yǎng)基最佳配方為A3B2C3，即KT 1.0 mg/L，6-BA 2.0 mg/L，PP3331.0 mg/L。經(jīng)方差分析，A2B2C3與A1B2C2、A3B2C1在0.05和0.01水平上差異均不顯著，但A2B2C3、A1B2C2和A3B2C1與其它6個處理在0.05水平上差異顯著。由于最佳條件的培養(yǎng)基不在正交試驗中，在后續(xù)驗證試驗中，我們比較了A3B2C3培養(yǎng)條件與A2B2C3培養(yǎng)條件，A3B2C3的增殖系數(shù)達(dá)6.91，而A2B2C3為6.57，并且在0.05水平上差異顯著。

圖1 滇黃精不定芽繼代增殖

表3 增殖培養(yǎng)基正交試驗優(yōu)化結(jié)果

2.2 生根培養(yǎng)基優(yōu)化

經(jīng)過15 d左右的培養(yǎng)，滇黃精莖段出現(xiàn)根系，隨后根的數(shù)量進一步增多。50 d后統(tǒng)計各處理的生根情況并對根系生長情況進行評價，其結(jié)果見圖2和表4。直觀分析顯示，影響滇黃精生根的因素主次順序為 A（IBA）＞C（MS）＞B（NAA），A2B2C3表現(xiàn)最佳，即IBA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+1/4 MS，生根系數(shù)達(dá)7.83，并且生根率為100%，根系粗壯，根量多，苗健壯。同時，A2B2C3與其它8個處理在5%水平上差異顯著。

圖2 滇黃精壯苗生根

表4 生根培養(yǎng)基正交試驗優(yōu)化結(jié)果

3 討論

本研究采用正交試驗的方法對滇黃精繼代增殖與生根培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化，對于滇黃精繼代增殖培養(yǎng)基，KT 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+多效唑1.0 mg/L組合表現(xiàn)最佳，并且在驗證試驗中驗證了其效果，其增殖系數(shù)達(dá)6.91。許麗萍等[6]以1/2MS+KT 2 mg/L作為滇黃精增殖培養(yǎng)基，增殖系數(shù)為4.12，但芽較細(xì)小。張智慧等[7]研究了BA和NAA對滇黃精增殖的影響，培養(yǎng)基MS+BA 4.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L表現(xiàn)較好，增殖系數(shù)為3.85，芽長勢較好?？梢钥闯觯訩T、BA和多效唑的組合較單用KT或BA+NAA的增殖效率要高。PP333通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)的激素平衡，在植物的生長過程中可發(fā)揮促進分枝及分蘗，控長矮化，提高葉綠素含量，它對于提高植物抗逆性和壯苗生根等有重要的作用[8]，目前PP333已用于小麥、水稻、玉米、獼猴桃、香蕉、油梨、葡萄等植物的花粉愈傷誘導(dǎo)及分化、試管苗保存、壯苗培養(yǎng)、胚挽救方面，并取得了較好的效果[9]。我們首次報道了多效唑用于滇黃精芽的增殖，并且增殖效果較為理想，這為PP333用于滇黃精工廠化育苗提供了試驗依據(jù)。

在本研究中，以IBA 0.2 mg/L+NAA 0.2 mg/L+1/4 MS為生根培養(yǎng)基，生根系數(shù)達(dá)7.83，并且生根率為100%，根系粗壯，根量多。張智慧等[7]以MS+NAA 0.5 mg/L和MS+IBA 0.5 mg/L為滇黃精生根培養(yǎng)基，生根率達(dá)100%，前者不定根生長較多，根系較長而細(xì)，后者不定根較短而粗，但并未給出生根系數(shù)。許麗萍等[6]報道了1/2MS+IBA1.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+CA 0.5 g/L為生根培養(yǎng)基，其生根率為67%，生根系數(shù)為1.77，該報道與本研究都使用了NAA和IBA，但生根率及生根系數(shù)差異較大，這可能跟激素濃度、所選材料及材料的基因型不同有關(guān)。根據(jù)我們的研究結(jié)果及前人研究結(jié)果，滇黃精生根選用IBA和NAA激素為佳。