程福珍，洪燕，鄭榮泉,2*，梅祎蕓，王志剛，張丹丹，李賢露

(1.浙江師范大學(xué)野生動物保護(hù)與利用技術(shù)中心 野生動物生物技術(shù)與保護(hù)利用浙江省重點實驗室，浙江 金華 321004;2.浙江師范大學(xué) 行知學(xué)院，浙江 金華 321004)

抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)是機(jī)體在受到病原體感染時產(chǎn)生的一類小分子多肽[1-2]，具有抗菌、抗病毒等生物活性，因其不易產(chǎn)生菌株耐藥性，成為各行業(yè)“新寵”[3]。棘胸蛙(Quasipaaspinosa)是我國特有的兩棲動物，俗稱石雞、石蛙、棘蛙，屬于兩棲綱、無尾目、蛙科、棘蛙屬，主要分布于我國長江以南地區(qū)的山澗溪流中。棘胸蛙體型碩大，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，具有清涼滋補(bǔ)、健肝胃、防癌抗癌等多種功效，兼具美食和藥用價值，素有“百蛙之王”的美名[3]。目前對棘胸蛙的研究主要集中在養(yǎng)殖和生物學(xué)特征等方面[4]，如人工養(yǎng)殖[5-6]、個體發(fā)育[7-8]、食性[9-10]、形態(tài)特征[11-12]、疾病防治[13-14]、染色體組型[15]等，而在生物活性肽領(lǐng)域的研究較少。已有研究表明，在棘胸蛙抗菌肽Spinosan-A、Spinosan-B、Spinosan-C、Spinosan-D中，Spinosan-D對革蘭氏陰、陽性菌的抗菌效果最佳[16]。

本研究對棘胸蛙抗菌肽Spinosan-D的原核表達(dá)進(jìn)行研究，以期為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

質(zhì)粒pET-32a(+)，北京Solarbio科技有限公司；E.ColiDH5α，日本TaKaRa公司；基因工程菌EColiBL21(DE3)pLysS，北京全式金生物有限公司。

氨芐霉素(母液濃度100 mg·mL-1，使用時每100 mL培養(yǎng)基添加50 μL氨芐霉素)、異丙基-β-D-硫代吡喃半半乳糖苷(IPTG)、LB培養(yǎng)基粉、甲酸、QuickCutHindⅢ限制性內(nèi)切酶、QuickCutEcoR I限制性內(nèi)切酶和DNA凝膠回收試劑盒，購于日本TaKaRa公司；Taq PCR Mastermix，購于康為世紀(jì)生物公司；Ni-NTA親和層析凝膠樹脂試劑盒、In-Fusion克隆試劑盒，購于美國Clontech公司；DNA Marker、11～245 ku蛋白質(zhì)Marker和質(zhì)粒抽提試劑盒，購于天根生化科技(北京)有限公司；LB培養(yǎng)基、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、蛋白質(zhì)染色液和蛋白質(zhì)脫色液，購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因合成

參考文獻(xiàn)[4]，設(shè)計含有EcoR I和Hind Ⅲ酶切位點、甲酸切割位點和蛋白質(zhì)終止密碼子的編碼Spinosan-D成熟肽的核酸序列(5′-GAATTCGATCCGATGGAGGAGCTCTACAAAGAAATCGACGA TTGTGTGAATTATGGCAATTGTAAAACCTTGAAACT CATGTAAAAGCTT-3′)。其中，GAATTC為EcoR Ⅰ酶切位點，AAGCTT為Hind Ⅲ酶切位點，GATCCG為甲酸切割位點。利用TaKaRa Clotech在線生成基因序列軟件設(shè)計特異性引物F(5′-ATCGGATCCGAATTCGATCCGATGGAGGAGCTCTA CAAA-3′)和R(5′-TGCGGCCGCAAGCTTTTACAT GAGTTTCAAGGTTTTACAATTGCCATA-3′)，全基因合成于T-Vector pMD19普通載體上。PCR反應(yīng)體系為：DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，反應(yīng)混合液12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共29個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。反應(yīng)結(jié)束后以1%瓊脂糖凝膠電泳分析是否獲得所需基因片段。

1.2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ雙酶切質(zhì)粒pET-32a(+)，回收線性化載體片段，取目的基因片段，用In-Fusion連接酶連接，構(gòu)建pET-32a(+)重組表達(dá)載體pET-32a(+)-Spinosan-D，并轉(zhuǎn)化至E.ColiDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性單克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為：菌液1 μL，pET-32a(+)通用引物S.TAG、T7 TER各1 μL，反應(yīng)混合液12.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共29個循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。PCR產(chǎn)物送至上海生工生化公司測序，運用Seqman和MEGA序列分析軟件分析測序結(jié)果。

1.2.3 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒至E.ColiBL21(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞中，再轉(zhuǎn)入另一培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min-1搖床培養(yǎng)至菌液的D600值為0.7。取1 mL菌液作為誘導(dǎo)前樣品，1 mL菌液中加入終濃度為1 mmol·L-1IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)(37 ℃、160 r·min-1條件下振搖4 h)，取1 mL菌液作為誘導(dǎo)后樣品。取誘導(dǎo)前、后樣品，12 000 r·min-1離心2 min，各加入40 μL PBS溶液懸浮菌體沉淀，加入10 μL的5×蛋白上樣緩沖液，以100 ℃煮沸10 min，取上清，分別取處理過的樣品各20 μL，進(jìn)行12% SDS-PAGE電泳檢測。

Whether in cooling or in energy generation mode, the efficiency of a thermoelectric device increases with the increasing of the figure-of-merit of the used thermoelectric semiconductors. The latter is written as[1]:

1.2.4 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

不同誘導(dǎo)表達(dá)條件下，蛋白的表達(dá)量不同。為使蛋白得到高效表達(dá)，進(jìn)行誘導(dǎo)溫度(16 ℃、28 ℃、37 ℃)、誘導(dǎo)時間(4、8、12 h)及IPTG終濃度(0.1、0.5、1.0 mmol·L-1)3因素3水平正交試驗，探索最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件，12% SDS-PAGE電泳檢測表達(dá)結(jié)果。

1.2.5 重組蛋白的純化

以最佳誘導(dǎo)條件對重組菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，冰上超聲裂解，離心，收集上清并過濾，對重組蛋白進(jìn)行純化，收集蛋白洗脫液，12% SDS-PAGE電泳分析目的蛋白。洗脫的目的蛋白加入終濃度為40%的甲酸，37 ℃培養(yǎng)36 h，37 ℃氮吹出去甲酸，加入1×PBS溶液清洗3次，最后用1×PBS溶液溶解。

1.2.6 重組蛋白生物活性檢測

將一定濃度的E.ColiDH5α菌液均勻涂布于固體培養(yǎng)基表面，將滅菌濾紙片按合適間距置于培養(yǎng)基表面，分別加入10 μL 1×PBS溶液、抗菌肽、1 mg·mL-1氨芐霉素，封口膜密封培養(yǎng)皿，水平倒置，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)，觀察抑菌圈是否形成及其大小。其中，氨芐霉素處理作為陽性對照，1×PBS溶液處理作為陰性對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 Spinosan-D基因擴(kuò)增及重組表達(dá)載體構(gòu)建及鑒定

Spinosan-D基因PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析大小為108 bp(圖1)，目的基因片段擴(kuò)增成功。

M，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；a，Spinosan-D基因擴(kuò)增產(chǎn)物

使用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ對質(zhì)粒pET-32a(+)進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳對雙酶切后的線性化載體進(jìn)行分析(圖2)，條帶符合預(yù)期結(jié)果，成功獲得線性化載體。純化回收的線性化載體，經(jīng)酶標(biāo)儀測量，濃度為14.5 ng·μL-1，目的基因片段濃度為62.5 ng·μL-1。

M，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；a，經(jīng)雙酶切的線性化pET-32a(+)載體；b，未經(jīng)雙酶切的環(huán)狀pET-32a(+)載體

菌液PCR后經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶大小為267 bp(圖3)，符合預(yù)期結(jié)果，初步鑒定重組質(zhì)粒構(gòu)建成功?；驕y序結(jié)果表明，已成功構(gòu)建重組質(zhì)粒。

2.2 重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)

對含重組質(zhì)粒的E.ColiBL21(DE3)pLysS大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后，結(jié)果表明，含IPTG誘導(dǎo)劑的目的條帶大小處有蛋白表達(dá)，而無IPTG誘導(dǎo)劑的在目的條帶大小處無蛋白表達(dá)(圖4)，表明融合蛋白在誘導(dǎo)劑IPTG作用下已經(jīng)成功表達(dá)。

M，DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；a，菌液PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；a，誘導(dǎo)前；b，誘導(dǎo)后

2.3 誘導(dǎo)條件優(yōu)化

研究發(fā)現(xiàn)，37 ℃條件下，融合蛋白的表達(dá)量更多(圖5)，故將最佳誘導(dǎo)溫度定為37 ℃。37 ℃條件下，不同誘導(dǎo)時間表達(dá)的融合蛋白量差異不明顯，選擇最短處理時間4 h為誘導(dǎo)時間。在37 ℃、誘導(dǎo)4 h時，1.0 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的融合蛋白最多，故最佳誘導(dǎo)條件為：37 ℃，1.0 mmol·L-1IPTG處理4 h。

A、B、C分別為16 ℃、28 ℃、37 ℃時不同IPTG終濃度及誘導(dǎo)時間下重組質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)。M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；a1、a2、a3、b1、b2、b3、c1、c2、c3分別表示誘導(dǎo)時間和IPTG終濃度為4 h、0.1 mmol·L-1，4 h、0.5 mmol·L-1，4 h、1.0 mmol·L-1，8 h、0.1 mmol·L-1，8 h、0.5 mmol·L-1，8 h、1.0 mmol·L-1，12 h、0.1 mmol·L-1，12 h、0.5 mmol·L-1，12 h、1.0 mmol·L-1誘導(dǎo)條件下的重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)

2.4 重組蛋白的純化

純化蛋白樣和未純化蛋白樣在20～25 ku有一條明顯條帶，約為21.2 ku(圖6)，符合預(yù)期結(jié)果，因此純化蛋白樣成功。

M，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；a，純化后；b，純化前

2.5 重組蛋白生物活性鑒定

在E.ColiDH5α菌株生長的平板上，陰性對照的PBS溶液周圍菌株生長正常；陽性對照的氨芐霉素周圍有抑菌圈；重組蛋白Spinosan-D周圍也存在抑菌圈(圖7)，表明抗菌肽Spinosan-D具有一定的抗菌活性。

3 討論

Dong等[16]從棘胸蛙皮膚中克隆出4條cDNA序列，并進(jìn)行了人工合成，根據(jù)抗菌肽的氨基酸組成特點以及二級結(jié)構(gòu)特點，將其命名為Spinosan-A、Spinosan-B、Spinosan-C、Spinosan-D。ProtParam分析表明，4種棘胸蛙抗菌肽的分子量在1 284～2 753，理論等電點在3.92～8.06，除Spinosan-C是陽離子多肽，其余的都是陰離子多肽。HNN在線二級結(jié)構(gòu)預(yù)測軟件分析表明，Spinosan-A、Spinosan-B以及Spinosan-C均沒有α-螺旋，具有較多的β-折疊和無規(guī)則卷曲，Spinosan-D具有明顯的兩親性且有43.48%的α-螺旋趨勢，而抗菌肽中的α-螺旋結(jié)構(gòu)能夠使微生物的細(xì)胞膜表面出現(xiàn)小孔，在不損傷正常細(xì)胞的前提下對細(xì)菌、真菌、病毒和癌細(xì)胞等有殺傷作用[17-18]，對抗菌肽的抗菌活性具有重要的作用。抗菌肽的溶血活性試驗顯示，80 μg·mL-1的高濃度棘胸蛙抗菌肽樣品對家兔紅細(xì)胞具有極微弱的溶血活性[19]。因此，對比4種棘胸蛙皮膚抗菌肽，Spinosan-D的各種活性效果更佳且穩(wěn)定。本研究對棘胸蛙抗菌肽Spinosan-D成熟肽進(jìn)行原核表達(dá)，為大量制備和利用這一具有重要應(yīng)用前景的活性肽提供基礎(chǔ)。

自抗菌肽首次被發(fā)現(xiàn)，人們已從細(xì)菌、真菌、兩棲類、高等動植物乃至人類中發(fā)現(xiàn)并分離獲得抗菌肽?？咕木哂蟹肿恿啃　⒘己玫臒岱€(wěn)定性和水溶性、廣譜抗菌活性及作用細(xì)菌后不易產(chǎn)生耐藥性、對病毒和癌細(xì)胞具有殺傷作用等特點受到關(guān)注，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化妝品及轉(zhuǎn)基因動植物農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域，顯示出巨大的應(yīng)用前景。由于天然抗菌肽在兩棲類動物機(jī)體中含量低且直接提取步驟復(fù)雜，化學(xué)合成20個以上的氨基酸成本高、難度較大且具有一定的污染性，因此，基因工程表達(dá)法是抗菌肽大規(guī)模生產(chǎn)的最佳途徑。利用基因工程方法表達(dá)蛋白質(zhì)已在酵母、昆蟲、大腸桿菌等多種異源宿主中獲得成功[20]。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)和大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)是表達(dá)蛋白質(zhì)的常用系統(tǒng)。巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的菌株穩(wěn)定，可以處理含二硫鍵的表達(dá)蛋白并能對表達(dá)后的蛋白進(jìn)行修飾，使得結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白表達(dá)后仍能保持其生物活性[21-22]?，F(xiàn)已報道的有14%的抗菌肽運用了巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)成功[23]，如Enterocin P[24]和ABP-CM4[25]等。然而，巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)同時也有不足之處，例如蛋白質(zhì)表達(dá)后難以純化，相對比大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)成本高，周期也相對較長等。大腸埃希菌表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最多、最完善、研究最為成熟的表達(dá)系統(tǒng)，該表達(dá)系統(tǒng)具有生產(chǎn)工藝簡單、周期短、能夠低成本進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵等特性，適合結(jié)構(gòu)簡單蛋白質(zhì)的表達(dá)?？咕慕Y(jié)構(gòu)簡單，不同于結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)需要經(jīng)過翻譯后的修飾加工過程才能轉(zhuǎn)化成活性形式，故本研究選用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)[26]。因抗菌肽分子量小，難以折疊正確和穩(wěn)定表達(dá)，易被宿主細(xì)胞中的酶水解，并且自身的抗菌作用會對宿主細(xì)胞產(chǎn)生毒性，目前對抗菌肽的原核表達(dá)幾乎都采用融合表達(dá)[27-28]，該表達(dá)方式便于純化，提高融合蛋白的可溶性表達(dá)，可避免蛋白酶作用以提高蛋白穩(wěn)定性[29]，又可使宿主細(xì)胞免于表達(dá)蛋白的毒性，目前通過融合表達(dá)的方法已成功獲得多種抗菌肽。

In-Fusion HD是一種相比于傳統(tǒng)克隆技術(shù)更加簡便、快速、高效的克隆技術(shù)，反應(yīng)時間僅需15 min，同時具備不受限制性內(nèi)切酶酶切位點限制的特點，克服了傳統(tǒng)克隆技術(shù)連接效率低、耗時長且需要特定限制性酶切位點的缺陷。Novagen的pET系統(tǒng)因基因被克隆到不被大腸埃希菌RNA聚合酶識別的T7啟動子之下而成為在大腸埃希菌中蛋白表達(dá)的首選，所以只有加入T7RNA聚合酶后，才會有表達(dá)?？寺〉絧ET載體的基因是被關(guān)閉的，不會因為產(chǎn)生的蛋白對細(xì)胞有毒性而引起質(zhì)粒不穩(wěn)定。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移到染色體上，含有一拷貝由lacUV5控制的T7RNA聚合酶基因的表達(dá)宿主中，并通過加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)；也可通過ICE6感染原始克隆宿主菌來提供T7RNA聚合酶。對于使用大腸埃希菌啟動子系統(tǒng)有困難的部分基因已在pET系統(tǒng)中實現(xiàn)穩(wěn)定克隆和表達(dá)。T7RNA聚合酶的選擇性和活性使得幾乎所有細(xì)胞資源都用于目標(biāo)基因表達(dá)，誘導(dǎo)后幾小時目標(biāo)產(chǎn)物就可超過細(xì)胞總蛋白的50%。pET-32a(+)中帶有硫氧還蛋白標(biāo)簽，使可溶性融合蛋白得到更大量的表達(dá)[30]，并能促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊[31-32]。本研究選用了pET系統(tǒng)中的pET-32a(+)作為構(gòu)建重組質(zhì)粒的載體，PCR得到目的基因，運用克隆高效、簡便、快速的In-Fusion HD技術(shù)成功獲得了重組質(zhì)粒Spinosan-D-pET-32a(+)。

規(guī)模化制備技術(shù)的研究，是開發(fā)和利用抗菌肽的基礎(chǔ)和保障。本研究利用原核表達(dá)技術(shù)成功獲得具有抗菌活性的抗菌肽Spinosan-D，是對規(guī)模化制備技術(shù)的有益探索。在今后的工作中，尚有以下幾方面值得進(jìn)一步深入研究：一是優(yōu)化含Spinosan-D-pET-32a(+)的E.ColiBL21(DE3)pLysS大腸埃希菌重組菌株的誘導(dǎo)表達(dá)條件或優(yōu)化Spinosan-D成熟肽基因；二是在本研究基礎(chǔ)上，開展棘胸蛙抗菌肽Spinosan-D原核表達(dá)的優(yōu)化試驗，以進(jìn)一步提高抗菌肽Spinosan-D的表達(dá)量；三是可開展抗菌肽Spinosan-D在真核生物表達(dá)系統(tǒng)中的分泌表達(dá)研究，比較不同表達(dá)系統(tǒng)的表達(dá)量，生物活性及試驗成本等。