高環(huán) 翟偉卜 孟菁 史金艷 張文蔚 齊放軍

摘要絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)途徑，由三種級次磷酸化的MAPKKK（MAPK kinase kinase）、MAPKK（MAPK kinase）和MAPK蛋白激酶組成，廣泛參與植物防御反應(yīng)的調(diào)控。本文利用已發(fā)布的陸地棉Gossypium hirsutum L全基因組數(shù)據(jù)，對其中的MAPK家族基因編碼序列進(jìn)行多序列比對和聚類分析。結(jié)果顯示，53個GhMAPK大都含有植物MAPK保守的TXY基序，并且能夠聚集到AtMAPK的A、B、C、D四個族中。進(jìn)而利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virtls-induced gene silencing，VIGS）技術(shù)，研究GhMAPK是否參與調(diào)控棉花對鏈格孢Azternaria alternata抗性。鏈格孢是引起棉花輪紋斑病并導(dǎo)致棉花早衰的主要病原真菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉默GhMAPK3、GhMAPK7、GhMAPK9及GhMAPKl9的棉花植株，抗病性顯著下降，表明這4種Gh-MAPK正調(diào)控棉花對鏈格孢的抗性。進(jìn)一步利用靶向性沉默策略，驗證這4種GhMAPK中各同源基因?qū)γ藁ㄦ湼矜呖剐缘恼{(diào)控作用。結(jié)果顯示，僅同源基因GhMAPK36、GhMAPK76、GhMAPK7c、GhMAPK9a、GhMAPK96、GhMAPKl96和GhMAPKl9c參與正調(diào)控棉花對鏈格孢的抗性，而同源基因GhlVIAPK3a、GhIVIAPK7a、ch-MAPK7d和GhlVIAPK19a并不調(diào)控棉花對鏈格孢的抗性。

關(guān)鍵詞棉花;絲裂原活化蛋白激酶;病毒誘導(dǎo)基因沉默;鏈格孢;抗病性

中圖分類號：S435.621.2文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.16688/j.ZWbh.2018175

植物生長過程中常會遭受環(huán)境中各類生物和非生物因子的脅迫。植物能夠感受和傳遞這些脅迫信號，并做出相應(yīng)的響應(yīng)。絲裂原活化蛋白激酶（mito-gen-activated protein kinase，MAPK）級聯(lián)途徑是參與調(diào)控植物抗病、抗逆反應(yīng)最普遍的信號傳導(dǎo)通路之一。MAPK級聯(lián)途徑由三種級次磷酸化的蛋白激酶組成，即MAPKKK、MAPKK和MAPK。植物受到外界環(huán)境脅迫時，會迅速產(chǎn)生信號分子激活MAPKKK;MAPKKK再通過磷酸化S/TXXXXXS/T基序激活MAPKK;而MAPKK又通過磷酸化T-X-Y基序中的Thr或Tyr殘基激活MAPK。

MAPK位于整個級聯(lián)的最下游，被激活后可滯留在細(xì)胞質(zhì)，也可進(jìn)入細(xì)胞核后再磷酸化各種底物，調(diào)控植物的生長發(fā)育以及各種脅迫響應(yīng)。不少研究報道了MAPK對植物抗病性的調(diào)控作用，擬南芥中fig22激活的級聯(lián)信號通路MEKKl-MKK4/5-MPK3/6在植株對真菌的抗性中起正調(diào)控作用，而另一級聯(lián)信號通路MEKKl-MKKl/2-MPK4起負(fù)調(diào)控作用。MPK3/MPK6在擬南芥中也可以通過促進(jìn)植保素的合成來增強植物的抗病性。水稻中的OsMKK3-OsMPK7-OsWRKY30信號通路正調(diào)控水稻對白葉枯病的抗性。煙草中的MAPK蛋白激酶NtWIPK和NtSIPK可介導(dǎo)過敏性細(xì)胞死亡，從而增強煙草對TMV的抗性。陸地棉中的GhMPK7和GhMPKl6與植物抗病反應(yīng)相關(guān)，GhMPK7參與水楊酸（salicylic acid，SA）介導(dǎo)的植物廣譜抗病性。異源表達(dá)GhMPKl6可增強擬南芥對鏈格孢和青枯假單胞菌Pseudo-monas solanacearum的抗性。

棉花是重要的經(jīng)濟(jì)作物，是世界范圍內(nèi)天然纖維的主要來源。近年來，棉花早衰在我國棉花種植區(qū)大面積發(fā)生，嚴(yán)重影響了棉花的產(chǎn)量和品質(zhì)。棉花早衰總會伴隨棉花輪紋斑病的發(fā)生。李莎等從棉花早衰葉片的病斑中分離到引起棉花輪紋斑病的鏈格孢Alternariaalternata。Zhao Jingqing等、齊放軍等研究揭示了棉花早衰與輪紋斑病問的內(nèi)在聯(lián)系，總結(jié)出我國棉花早衰發(fā)生的關(guān)鍵成因：生長中后期，在低溫、營養(yǎng)缺乏等因素的作用下，棉花抗病性下降，易于遭受鏈格孢菌侵染，引起輪紋斑病發(fā)生，并最終導(dǎo)致棉花早衰。因此，增強棉花對鏈格孢的抗性有利于防控棉花早衰。本文利用病毒誘導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)，研究了陸地棉MAPK對鏈格孢抗性的調(diào)控作用。

1材料與方法

1.1試驗材料

棉花材料‘新陸早13號和鏈格孢菌株Alter-naria alternata A1為本實驗室保存;用于VIGS試驗的棉花葉皺縮病毒Cotton lea f crumple virus，CLCrV沉默載體pCLCrVA和pCLCrVB由本所周雪平教授饋贈;pMDl8-T載體購自TaKaRa大連公司;大腸桿菌E.coli DH5a購于全式金（北京）生物有限公司。

1.2陸地棉MAPK基因家族的篩選及信息收集

陸地棉的全基因組信息來自網(wǎng)站（http：∥mascotton.njau.edu.cn/），在其主頁面的Data菜單中獲得全基因組的注釋信息、CDS序列及其編碼的蛋白序列。依據(jù)其功能注釋，篩選出陸地棉MAPK家族的基因。同時，從擬南芥信息資源數(shù)據(jù)庫TAIR（https：∥WWW.arabidopsis.org/）主頁面中獲取擬南芥MAPK基因的CDS序列及其編碼的蛋白序列。

1.3陸地棉MAPK基因家族的多序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 6.06（molecular evolutionary ge-netics analysis）軟件中的ClustalW功能對所有陸地棉MAPK的蛋白序列進(jìn)行多序列比對，設(shè)置參數(shù)為默認(rèn)。并利用MEGA 6.06中的鄰接法（neighbor-joining）將陸地棉MAPK蛋白編碼序列和擬南芥Arabidopsis thaliana L.MAPK蛋白編碼序列一起進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，校驗參數(shù)自舉值bootstrap設(shè)置為1000次重復(fù)，用于檢測系統(tǒng)進(jìn)化樹各部分的置信度。

1.4構(gòu)建沉默棉花MAPK基因的VIGS載體

利用SGN VIGS Tool在線網(wǎng)站（http：∥vigs.solgenomics.net/）選擇各GhMAPK基因的靶向性沉默片段。再利用Primer Premier 5軟件設(shè)計各GhMAPK基因沉默片段的擴(kuò)增引物，為了更好地沉默目的基因，其沉默片段長度盡量控制在300～500bp范圍內(nèi)，設(shè)計的引物由上海Invitrogen公司合成。引物信息見表1。