程姣姣 阮祥燕，2* 周 琦 李揚璐 杜 娟 金鳳羽 谷牧青 Alfred O. Mueck，2

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院內分泌科，北京 100026；2.德國圖賓根大學婦產醫(yī)院婦女健康部與婦女健康研究中心，圖賓根 D-72076，德國；3.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院婦科，北京 100026；4.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產醫(yī)院生殖醫(yī)學科，北京 100026)

早發(fā)性卵巢功能不全(premature ovarian insufficiency，POI)指的是女性40歲之前出現卵巢功能減退，>4個月的停經或月經不調，間隔>4周的連續(xù)2次檢測卵泡刺激素(follicle stimulating hormone, FSH)>25 IU/L[1-2]。POI的病因復雜[3]，50%的患者特發(fā)性病因，即原因不詳[4-5]，但也約20%的患者是醫(yī)源性因素，包括手術和/或性腺毒性治療，如放射治療(以下簡稱放療)、化學藥物治療(以下簡稱化療)、造血干細胞移植等[6]。POI患者生育力大大下降，自然妊娠率約5%[7]，POI患者心血管疾病、骨質疏松癥、癡呆等發(fā)病率以及各種疾病的早死風險增加[1，5]。

卵巢組織凍存移植(ovarian tissue cryopreservation and transplantion，OTCP)[8-10]是一種新興的生育力保護方法，是指在患者性腺毒性治療(放療、化療)之前通過腹腔鏡手術或者開腹手術取出部分卵巢組織轉移到卵巢組織凍存庫進行處理、冷凍與凍存，待患者性腺毒性治療結束至少半年、原發(fā)病臨床痊愈后將凍存的卵巢組織復蘇并移植回患者體內[11]。卵巢組織凍存移植是青春期前女性以及放、化療無法延遲女性的唯一生育力保護選擇[12-14]，卵巢組織凍存移植不僅可以保存患者的生育力，也保存了患者的卵巢內分泌功能[15-16]。在歐洲等發(fā)達國家，卵巢組織凍存移植技術已不再是試驗性技術，可廣泛運用于臨床[17-18]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級健康的雌性SD大鼠，10周齡，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物許可證號：SCXK(京)2011-0012。飼養(yǎng)在環(huán)境溫度為20～24 ℃、環(huán)境濕度為50%～70%的SPF級動物房內，正常日光周期，自由進食及飲水，保持墊料干燥，每3只一籠。該動物實驗倫理已通過首都醫(yī)科大學動物部倫理委員會批準，倫理審批號：AEEI-2018-163。

1.2 動物的實驗分組和流程

1.3 大鼠不同卵巢體積切除手術

SD大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，劑量為40 mg/kg，取俯臥位，剃除其背部兩側毛發(fā)，依次用碘伏及75%(體積分數)乙醇對大鼠背部皮膚進行消毒，無菌條件下分別于其左右側背部卵巢位置平行于脊柱方向剪開皮膚及肌層，各做一約1.5 cm長度的小口，暴露腹腔，找到卵巢脂肪墊，以鈍頭鑷子夾取卵巢脂肪墊，連同卵巢及部分子宮，取出腹腔，采用眼科剪剪去不同體積的卵巢，將子宮及剩余卵巢連同脂肪墊小心回納入腹腔，分別縫合其肌層及皮膚。

1.4 大鼠動情周期觀察

整個觀察研究期間，每天早上9至10點進行大鼠陰道脫落細胞涂片，固定大鼠，暴露出陰道，用移液槍吸取50 μL 0.9%(質量分數)氯化鈉注射液，小心將移液器槍頭插入大鼠陰道0.5～1.0 cm，輕輕吹打3次后吸出，涂片，晾干后備用。在相同的環(huán)境下統(tǒng)一進行陰道細胞涂片染色，染色方法采用瑞氏-姬姆薩染液染色法，在自然干燥的涂片上滴加瑞氏-姬姆薩染液2～3滴覆蓋整個標本涂片，染1～2 min后，滴加等量pH值為6.4的磷酸鹽緩沖液(或等量超純水)，輕輕晃動玻片，與瑞氏-姬姆薩染液充分混勻，染色3～5 min。水洗、吸干、并通過顯微鏡(100×)觀察。鏡下識別出3種類型的細胞：圓形細胞和有核細胞是上皮細胞；沒有細胞核的不規(guī)則細胞是角質化細胞；小環(huán)細胞是白細胞，它們的相互比例用于判斷動情周期的不同階段。動情間期陰道細胞以白細胞為主，動情前期陰道細胞以有核細胞為主，動情期陰道細胞以成片的角化上皮細胞為主，動情后期陰道細胞中白細胞、有核細胞、上皮細胞均可見[20]。

1.5 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 大鼠動情周期不同時期陰道細胞涂片

陰道細胞涂片的典型圖片見圖1， 圖1A涂片可見大量的白細胞，圖1B涂片可見大量有核上皮細胞，圖1C涂片可見大量成片角化上皮細胞，圖1D可見白細胞、有核上皮細胞以及角化上皮細胞。

2.2 切除不同卵巢組織體積對大鼠動情周期的影響

2.3 切除不同卵巢組織體積對大鼠體質量的影響

在卵巢部分切除術后的4、6、8、10、12周，F組(去勢組)與其他5組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，F組大鼠的體質量顯著高于其他5組，A、B、C、D、E組間差異沒有統(tǒng)計學意義(P>0.05)，詳見表2，圖3。

圖1 大鼠動情周期不同時期陰道細胞涂片的典型圖片Fig.1 Typical pictures of vaginal cell smears at different periods of estrous cycle in rats (Wright’s-Giemsa staining， 100×)

A: diestrus；B: proestrus；C: estrus；D: metestrus.

表1 各組大鼠動情周期的比較

GroupNumberofcases4Weeks8Weeks12WeeksA124.5±0.774.92±0.665.50±1.05B124.58±0.384.67±0.525.17±0.41C104.42±0.495.67±0.824.67±0.52D124.25±0.504.50±1.006.00±0.00E115.80±0.847.00±2.007.4±0.19F78.50±1.768.67±2.168.67±0.82F17.6678.22712.036P<0.001<0.001<0.001

圖2 不同時間不同組大鼠的動情周期Fig.2 Rat of estrous cycle in different groups at different times

GroupNumberofcaseBaseline4Weeks6Weeks8Weeks10Weeks12WeeksA12251.77±6.32287.47±11.40288.54±17.80295.58±15.16302.73±18.01309.46±19.41B12256.78±6.82284.20±12.31287.15±13.83304.23±16.38295.93±19.46304.55±20.97C10258.95±8.36297.98±15.07284.15±16.93292.95±23.83299.95±23.83297.33±25.68D12250.51±6.32270.20±11.40303.07±12.80315.73±15.16326.94±18.01338.83±19.41E11260.20±7.47304.62±13.48292.78±15.14310.26±17.94320.68±21.31336.66±22.97F7252.60±6.32336.96±11.40356.61±12.80377.59±15.16387.46±18.01402.00±19.41F0.333.9864.2263.9423.3883.590P0.8910.0070.0050.0070.0150.012

圖3 不同時間不同組大鼠的體質量Fig.3 Rat of weight in different groups at different times

*P<0.05vsGroup A，Group B，Group C，Group D，Group E.

3 討論

3.1 保留不同卵巢組織體積對動情周期的影響

放射治療聯合化學藥物治療(以下簡稱放化療)卵巢組織的損傷以及發(fā)生POI的可能性與放療和/或化療類型、劑量、患者的年齡、本身的卵巢儲備功能都有關系[21]，卵巢組織凍存患者的年齡一般不超過35歲[12，22]，如果患者的卵巢功能好，可適當放寬年齡限制。一旦年輕女性患者確診為癌癥，放化療方案確定后，發(fā)生POI的可能較高時，可考慮增加卵巢組織凍存量[18]，或者如果患者情況允許，可配合其他的生育力保護方案，如卵子凍存、胚胎凍存等[23-24]。截止到2017年7月，全球已有超過132名通過卵巢組織凍存移植技術誕生的嬰兒[17]，截止到目前，已有超過154名嬰兒，卵巢組織移植后超過95%的患者恢復了卵巢正常的內分泌功能[25-26]，Van der Ven等[27]報道了FertiPROTEKT生殖力保護網絡更新了最新的匯總數據，在卵巢組織凍存時年齡<35歲的女性中，卵巢組織移植后的妊娠率為33%，在超過35歲的女性中，妊娠率為18%[28]。Meirow等[29]報道了卵巢組織移植后妊娠率為53%，活產率為32%。這些充分說明了卵巢組織凍存移植技術的成熟與可靠，歐洲等發(fā)達國家已將此技術設定為臨床常規(guī)[22，30-31]。

3.2 保留不同卵巢組織體積對體質量的影響

本研究設定6個時間點監(jiān)測大鼠的體質量，本研究中切除雙側的卵巢組織大鼠的體質量明顯高于其余5組的大鼠。雌性大鼠去勢后將不再分泌雌孕激素，但雌激素對機體脂肪分布和脂肪細胞分化有重要影響，雌激素和雌激素受體調節(jié)葡萄糖和脂質代謝的各個方面，雌激素缺乏會使得腹部脂肪堆積，育齡期婦女和更年期婦女的體質量和腹部脂肪分布不同，并且絕經女性體質量增加、超重及肥胖是公共衛(wèi)生問題。40～59歲女性肥胖的發(fā)生率約65%，超過60歲的女性肥胖的發(fā)生率約73.8%[32]，但絕經女性肥胖發(fā)生率增加的原因尚不清楚。

3.3 局限性和不足

本研究的設計存在不足之處，未定期采血檢測SD大鼠血清中卵巢激素濃度或其他指標以充分補充或證實本研究結論。本實驗只觀察了3個月，只能得出觀察的3個月時間內每組大鼠動情周期和體質量的變化。