段 楠 黃辰煒 逄 璐 李海霞

(北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，北京 100034)

糖尿病腎病(diabetic kidney disease，DKD)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)的微血管合并癥之一，也是慢性腎臟疾病(chronic kidney disease，CKD)的最常見病因，最終引起終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)和過早死亡[1-2]。持續(xù)高血糖環(huán)境所形成的晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)可能造成糖尿病腎臟損傷，糖化白蛋白(glycated albumin，GA)是AGEs前體之一，目前在臨床上是反映近2～3周平均血漿葡萄糖濃度的有效指標。本課題組前期研究[3]顯示，GA能夠上調(diào)腎小管損傷相關(guān)分子的表達，并促進炎性細胞因子的分泌從而對腎小管造成損傷。Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)信號通路與炎性反應(yīng)相關(guān)，參與糖尿病等非感染性炎性疾病的發(fā)生發(fā)展，而GA對其的影響尚不明確。齊墩果酸(oleanolic acid，OA)是一種天然五環(huán)三萜類化合物，近年來發(fā)現(xiàn)其具有降糖及改善DM的作用[4]，其能否降低GA介導(dǎo)的腎小管損傷也不清楚。本研究擬用GA和OA處理人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞系)，觀察腎損傷分子-1(kidney injury molecule-1，KIM-1)和中性粒細胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL)腎損傷相關(guān)分子水平，并探討GA和OA對Toll樣受體信號通路的作用。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

糖化白蛋白、齊墩果酸(Sigma公司，美國)，人晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end-products,RAGE)抗體(R&D公司，美國)，DMEM F-12培養(yǎng)基(Hyclone公司，美國)，胎牛血清(Gibco公司，美國)，青霉素、鏈霉素和兩性霉素B(Lonza公司，美國)，胰蛋白酶消化液(Gibco公司，美國)，Trizol、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?GreenPCR熒光染料(Invitrogen公司，美國)，人類KIM-1和NGAL ELISA試劑盒(R&D公司，美國)，兔源性抗p38 MAPK抗體、抗IRAK4抗體、抗TLR1抗體、抗TLR2抗體、抗TLR7抗體及抗TLR9抗體(Cell Signaling Technology公司)，BCA 蛋白濃度測定試劑盒(索萊寶科技有限公司，中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

實驗使用人近端腎小管上皮細胞HK-2細胞系，購自美國標準培養(yǎng)物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。細胞培養(yǎng)于含有10%(體積分數(shù))胎牛血清，1×10 000 U/L青霉素、10 000 μg/L鏈霉素及20 μg/L兩性霉素B的DMEM-F12培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，培養(yǎng)于37 ℃、5%(體積分數(shù))CO2的飽和濕度空氣培養(yǎng)箱。倒置顯微鏡下觀察形態(tài)，3 d左右HK-2細胞生長融合成單層細胞，呈典型的鋪路石狀鑲嵌排列。

1.2.2 細胞分組與刺激

取生長良好的HK-2細胞接種于六孔板，待細胞生長至視野70%～80%匯合時，使用無血清DMEM-F12培養(yǎng)基同步化12 h，采用數(shù)字表法隨機分成對照組與實驗組, 刺激濃度參考課題組前期研究[3]與預(yù)實驗結(jié)果：(1)空白對照組：無刺激；(2)人GA組：0.5 mg/mL GA[3]；(3)GA+抗RAGE抗體組：0.5 mg/mL GA[3]，10 μg/mL RAGE抗體(依據(jù)R&D試劑說明書，當濃度達10 μg/ mL時，該抗體能夠阻斷>90%的受體-配體結(jié)合)；(4)GA+OA組：0.5 mg/mL GA[3]，80 μmol/mL OA(預(yù)實驗提示的最小有效濃度)。對以上各組細胞分別進行24 h刺激，每組實驗重復(fù)3次。

1.2.3 實時熒光定量PCR測定細胞中KIM-1與NGAL mRNA

按照Trizol說明書提取各組細胞總RNA，以2 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，在ABI 7500儀器(Life Tech公司, 美國)進行熒光實時定量PCR(real-time PCR)?？偡磻?yīng)體積20 μL，反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃10 min，變性95 ℃ 15 s及退火60 ℃ 60 s(共40個循環(huán))。引物設(shè)計使用Primer Premier 3.0，由生工(上海)公司合成，稀釋為 10 μmol/L工作液，序列見表1。每次3個復(fù)孔，每個實驗重復(fù)3次。目的基因mRNA Ct 值用GAPDH Ct值校正。根據(jù)所得Ct值，運用2-ΔΔCT相對定量法計算內(nèi)參、目的基因的相對表達量。

1.2.4 ELISA法測定培養(yǎng)上清液中KIM-1與NGAL

各組細胞在相應(yīng)物質(zhì)處理后，分別收集上清液。按照說明書進行ELISA反應(yīng)，各步驟結(jié)束后30 min內(nèi)使用酶標儀于450 nm波長處讀取每孔吸光度值，根據(jù)吸光度值與倍比稀釋濃度建立KIM-1和NGAL濃度的標準曲線，樣品中KIM-1和NGAL濃度從標準曲線讀取。

1.2.5 實時熒光定量PCR測定細胞中Toll樣受體信號通路傳導(dǎo)的表達

細胞RNA的提取、cDNA的制備以及Real-time PCR的具體操作步驟詳見上述的“1.2.3”。Toll樣受體信號通路中關(guān)鍵激酶p38 MAPK與IRAK4，以及TLR1、TLR2、TLR7和TLR9的引物設(shè)計使用Primer Express 3.0，結(jié)果與Pub-Med BLAST比對，引物由生工(上海)公司合成，稀釋為10 μmol/L工作液，序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.6 Western blotting法檢測細胞中Toll樣受體信號通路蛋白的表達

提取各組HK-2蛋白后采用BCA試劑盒對蛋白質(zhì)定量分析后，取總量相等的蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)法電泳，轉(zhuǎn)膜后5%(質(zhì)量分數(shù))脫脂奶粉非特異性封閉1.5 h。加入一抗(1∶500)，4 ℃過夜。以HRP標記的山羊抗兔抗體(1∶5 000)室溫避光孵育1 h，ECL超敏發(fā)光液孵育1 min，將膜放入凝膠成像分析系統(tǒng)中顯影。用Image J 1.52版軟件分析待測蛋白條帶灰度與作為內(nèi)參的GAPDH蛋白條帶灰度的比值作為該蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 GA與OA對HK-2細胞KIM-1和NGAL mRNA表達的影響

相對于空白對照組，GA組細胞KIM-1和NGAL的mRNA表達均出現(xiàn)顯著性上升(P<0.05)，而GA+抗RAGE抗體、GA+OA兩組的細胞無顯著性變化。并且，GA+抗RAGE抗體組、GA+OA組細胞中KIM-1和NGAL的mRNA表達顯著低于GA組(P<0.05)；GA+OA組與GA+抗RAGE抗體組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

2.2 GA與OA對HK-2細胞KIM-1和NGAL釋放的影響

相較于空白對照組，GA刺激24 h后，HK-2細胞上清液中KIM-1和NGAL的水平均出現(xiàn)顯著上升(P<0.05)(圖2)。與GA組細胞對比，加入抗RAGE抗體(即GA+抗RAGE抗體組)與OA(即GA+OA組)可使KIM-1及NGAL的釋放均有所下降，且加入OA后能顯著下調(diào)HK-2細胞上清液中NGAL(P<0.05)；GA+OA組與GA+抗RAGE抗體組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

圖1 各組HK-2細胞KIM-1及NGAL mRNA水平Fig.1 mRNA expression of KIM-1 and NGAL in HK-2 cells

A: mRNA expression of KIM-1 in HK-2 cells；B: mRNA expression of NGAL in HK-2 cells；Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3;KIM-1：kidney injury molecule-1；NGAL: neutrophil gelatinase-associated lipocalin；GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid..

圖2 各組HK-2細胞上清液KIM-1及NGAL蛋白釋放 Fig.2 Release of kidney injury molecule-1 in culture supernatants of HK-2cells

A: release of KIM-1 in culture supernatants of HK-2 cells；B: release of NGAL in culture supernatants of HK-2 cells；Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3;KIM-1：kidney injury molecule-1；NGAL: neutrophil gelatinase-associated lipocalin；GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid.

2.3 GA與OA對HK-2細胞Toll樣受體信號通路mRNA表達的影響

與空白對照組相比較，GA組具有顯著升高的p38 MAPK、IRAK4、TLR1、TLR7和TLR9 mRNA的表達(P<0.05)，其TLR2 mRNA無顯著性變化；并且，相較于單純GA刺激組，加入抗RAGE抗體以及OA后能顯著抑制上述上調(diào)作用(P<0.05)(圖3)。

圖3 各組細胞Toll樣受體信號通路mRNA水平Fig.3 mRNA expression of toll-like receptor pathway in HK-2 cells

Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3;GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid.

2.4 GA與OA對HK-2細胞Toll樣受體信號通路蛋白表達的影響

各處理組細胞內(nèi)中未檢測到TLR7和TLR9有效值。相較于空白對照組相，GA組具有較高的p38 MAPK、IRAK4、TLR1和TLR2的蛋白表達，以上兩組間p38 MAPK與IRAK4差異有統(tǒng)計學(xué)意義(圖4A，4B)(P<0.05)。在加入OA后，細胞內(nèi)p38 MAPK、IRAK4、TLR1和TLR2的蛋白相對于單純GA刺激組顯著下降(P<0.05)，并與GA+抗RAGE抗體組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4C，4D)。

3 討論

本研究應(yīng)用GA刺激人近端腎小管上皮細胞(HK-2細胞)模擬DKD腎小管損傷的細胞模型，筆者觀察到GA能促進HK-2細胞KIM-1和NGAL等腎小管損傷相關(guān)分子的表達與釋放，并上調(diào)TLR1、TLR7、TLR9以及p38 MAPK與IRAK4等炎性反應(yīng)通路關(guān)鍵激酶的表達，即GA可能通過激活Toll樣受體信號通路，在腎損傷過程中起重要作用。在GA刺激情況下分別加入OA和抗RAGE抗體，能夠顯著減弱GA對腎小管損傷相關(guān)分子及以上反應(yīng)通路關(guān)鍵激酶信號傳導(dǎo)的促進作用，提示OA能夠干預(yù)GA調(diào)控的損傷。

DKD的具體發(fā)病機制尚未完全明確，許多因素參與其發(fā)病[5]。其中，高血糖環(huán)境能夠通過信號通路的改變、細胞因子的表達以及自由基的產(chǎn)生非酶促誘導(dǎo)形成AGEs，進而高血糖與AGEs共同影響腎小管的功能；RAGE屬于受體免疫球蛋白超家族，AGEs能夠通過與其的相互作用，觸發(fā)其二級信使途徑(secondary messenger pathways)的激活，參與DKD的發(fā)病機制[6]。

圖4 各組細胞Toll樣受體信號通路蛋白表達Fig.4 Protein expression of toll-like receptor pathway in HK-2 cells

A: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of IRAK-4 HK-2 cells；B: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of p38 MAPK in HK-2 cells；C: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of TRL1 HK-2 cells；D: Western blotting and statistical analysis for the relative amount of TLR2 HK-2 cells；Data were presented as mean±SD.*P<0.05vscontrol group,#P<0.05vsGA group,n=3；IRAK4: interleukin-1 receptor-associated kinase 4;GA:glycated albumin;RAGE:receptor for advanced glycation end-products;OA:oleanolic acid;TLR: Toll-like receptor.

糖基化蛋白質(zhì)GA為AGEs的前體之一，可反映近期(2～3周)平均血漿葡萄糖濃度，在臨床上作為監(jiān)測血糖波動的指標。OA是一種具有抗炎、抗菌、降糖作用的天然抗氧化物，能夠降糖并改善DM。本研究模擬體外糖基化刺激腎損傷的細胞模型，將HK-2細胞置于人血清GA、GA+抗RAGE抗體組與GA+OA的環(huán)境中，觀察各情況下腎小管損傷相關(guān)分子和Toll樣受體信號通路的表達情況。

目前，OA在許多中藥及其制劑中皆作為定量指標，并于疾病模型中被廣泛研究，其中包括糖尿病和腎損傷。研究[7]顯示，STZ-誘導(dǎo)的糖尿病大鼠經(jīng)OA處理后肌酐清除率(creatinine clearance rate，Ccr)有所升高，且腎小球濾過率(glomerular filtration rate, GFR)的下降存在OA劑量依賴性改善，作為腎功能損害的重要指標尿白蛋白也有所降低；糖尿病小鼠經(jīng)OA治療一定時間后，Ccr與血漿胰島素濃度升高，AGEs相關(guān)物質(zhì)如GA、糖化血紅蛋白及Nε-羧甲基賴氨酸等皆出現(xiàn)下降[8]。KIM-1表達于去分化的近端腎小管上皮細胞，在腎損傷時釋放到尿液中并且與腎小管間質(zhì)的炎性反應(yīng)和纖維化相關(guān)，被認為是早期腎損傷的標志物；NGAL是一種小相對分子質(zhì)量分泌性蛋白，在腎臟受到損傷性刺激時由腎小管上皮細胞分泌至血液、尿液中，是診斷急性腎損傷有效的生物學(xué)標志之一[9-10]。本研究顯示，GA能顯著上調(diào)HK-2細胞中腎損傷相關(guān)分子KIM-1和NGAL的表達與釋放，而經(jīng)過GA與OA共同處理后，KIM-1及NGAL的mRNA與蛋白水平有所下降，且與抗RAGE抗體封閉AGEs結(jié)合位點的實驗組差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示OA能夠干預(yù)GA調(diào)控的腎小管損傷。研究[11]表明，OA抵抗糖基化反應(yīng)的作用不僅通過降糖效應(yīng)而體現(xiàn)，而且還能夠直接有效抑制AGEs的形成，本實驗中以O(shè)A處理經(jīng)GA刺激的HK-2細胞，其KIM-1及NGAL水平與抗RAGE抗體阻斷AGEs受體-配體結(jié)合實驗組無明顯區(qū)別，顯示OA可能通過降低腎臟糖基化反應(yīng)引起的損傷，在DM及DKD病程中對腎臟具有保護作用。

近期研究[12-13]顯示，免疫與代謝系統(tǒng)結(jié)合緊密，Toll樣受體信號通路的激活能夠啟動信號級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細胞因子(趨化因子)的產(chǎn)生，從而引發(fā)炎性反應(yīng)，并且參與非感染性炎性疾病(如糖尿病、癌癥和肥胖等)的發(fā)生發(fā)展。本課題組前期研究[3]顯示，GA能夠促進炎性細胞因子的分泌從而對腎小管造成損傷，此次實驗顯示，GA可顯著上調(diào)HK-2細胞TLR1、TLR7和TLR9 mRNA水平，以及p38 MAPK與IRAK4等Toll樣受體信號通路關(guān)鍵激酶的mRNA與蛋白表達，提示其能夠通過激活此通路而發(fā)揮作用。考慮到TLR7和TLR9存在于內(nèi)溶酶體中[14]，mRNA經(jīng)轉(zhuǎn)錄翻譯后蛋白表達量較低，因而通過Western blotting法并未檢測到二者有效值。當GA刺激組下分別加入OA，上述表達均顯著下降，且與抗RAGE抗體加入后的表達情況差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明OA能夠干預(yù)GA調(diào)控的Toll樣受體信號傳導(dǎo)，在抵抗糖基化反應(yīng)過程中對腎臟具有保護作用。

綜上所述，GA作為AGEs前體能夠上調(diào)KIM-1和NGAL等腎損傷相關(guān)分子的表達與釋放，激活Toll樣受體信號通路，對人近端腎小管上皮細胞造成損傷；而具有降糖及改善DM作用的OA能夠有效干預(yù)GA調(diào)控的上述損傷。因此，對DM患者進行GA檢測，可提示與評估患者腎臟受累情況，預(yù)測DKD的發(fā)生發(fā)展；并且，將OA對糖尿病腎損傷的干預(yù)、治療作用通過進一步的臨床研究與驗證后應(yīng)用于臨床治療，能夠為DKD的保護靶點與治療方案提供思路。