苗玉迪 焦紅霞 李慶瑞

急性髓系白血病(acutemyeioid leukemia，AML)在分子生物學、形態(tài)學、細胞遺傳學上有著極大的異質(zhì)性[1-4]。MicroRNAs(miRNAs)是1類進化高度保守、內(nèi)源性的小分子編碼RNA，可參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、遷移等多種生物學事件[5-6]。miR-125b已被證實定位于染色體11q23和21q21兩個位點，其在不同類型癌癥中表現(xiàn)出不同的特性，既可作為腫瘤抑制因子，又可作為啟動子參與癌癥的發(fā)生發(fā)展[7-9]。當前研究表明促凋亡家族蛋白Bak1在AML患者原代細胞凋亡中發(fā)揮重要作用[10-11]，但是與miRNAs的關系還無相關報道。本文具體探討了miR-125b通過靶向抑制Bak1表達影響人髓系白血病細胞增殖的機制研究及意義，旨在完善AML發(fā)生發(fā)展中的新機制，為尋找新的靶向治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人AML細胞株THP-1購自中科院武漢細胞庫，人胚腎HEK293細胞系由我院凍存；DMEM細胞培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；脂質(zhì)體LipofectamineTM3000、Annexin V-FITC PI細胞凋亡檢測試劑盒購于美國Invitrogen公司；胎牛血清購自美國Gibco公司；MTT增殖檢測試劑盒購于美國Promega公司；兔抗人一抗購自英國Abcam公司；HRP抗兔二抗購自英國Abcam公司；miR-125b mimics、inhibitor Negtive Control(NC)購于上海吉瑪生物技術有限公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)購于美國Promega公司。

1.2 細胞轉染

取對數(shù)生長期THP-1細胞胰酶消化后，以1×106細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜后進行轉染。適量miR-125b mimics、miR-125b inhibitor轉移至離心管中，使得miR-125b mimics、miR-125b inhibitor、miR-125b NC終濃度分別為50 nM、100 nM、100 nM(miR-125b mimics組、miR-125b inhibitor組、NC組)。將miRNA與轉染試劑LipofectamineTM3000混合液加入培養(yǎng)細胞中，轉染完成后采用DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測細胞增殖

取對數(shù)生長期THP-1細胞經(jīng)胰酶消化后，用含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基調(diào)整細胞濃度至1×105個/ml，培養(yǎng)至相應時間節(jié)點時，每孔加入20 μl 0.5 mg/ml MTT溶液，6 h后終止培養(yǎng)，每孔加入150 μl DMSO，震蕩10 min后使用酶標儀540 nm波長處檢測與計算增殖活性。

1.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期THP-1細胞，調(diào)整細胞濃度至1×103個/ml，接種于6孔培養(yǎng)板；培養(yǎng)至相應時間節(jié)點時將細胞采用胰酶消化，1 000 rpm×5 min離心棄上清，加入200 μl結合緩沖液重懸細胞，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI雙標記后，避光反應15 min，采用流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.5 miR-125b mRNA表達檢測

轉染48 h后取所有組別的細胞，提取RNA，采用熒光定量PCR檢測miR-125b mRNA相對表達量，ΔΔCt為mRNA的相對表達量，ΔΔCt=實驗組[Ct(miR-125b)-Ct(GAPDH)]-對照組[Ct(miR-125b)-Ct(GAPDH)]。

1.6 Western-blot法檢測蛋白表達水平

取對數(shù)生長期THP-1細胞，胰酶消化后提取細胞的總蛋白，每組取20 μg蛋白跑SDS-PAGE膠，轉膜后進行過夜封閉，剪成將對應大小的條帶放入含有相應一抗溶液的抗體孵育盒中(稀釋比例為1∶1 000)，4 ℃過夜，TBST洗滌后，再將膜置于相應種屬的二抗中(稀釋比例為1∶5 000)，室溫孵育1 h，TBST洗滌后進行ELC顯色，檢測Bak1、GAPDH、AKT、PI3K蛋白表達水平。

1.7 熒光素酶雙報告實驗

查找并確定Bak1和miR-125b可能相互作用的具體位置，截取一段40～60 bp包含種子序列的序列。突變序列設計時靶種子序列依次替換成互補的堿基，由上海生工生物有限公司合成。構建構建熒光素酶報告基因質(zhì)粒pGL3-Bak1-3'UTR報告載體，將報告載體與miR-125b mimic共轉染HEK293細胞。轉染48h后收集HEK293細胞，裂解細胞后用熒光素酶雙報告系統(tǒng)測定螢火蟲熒光素酶以及海腎熒光素酶的活性，兩者比值降低表明兩者間可以相互作用。

1.8 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 miR-125b表達對比

miR-125b mimics轉染后THP-1細胞中miR-125b表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，miR-125b inhibitor轉染后細胞中miR-125b水平則顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 不同組別THP-1細胞中miR-125b相對表達量對比

注：與NC組對比，*為P<0.05；與miR-125b inhibitor組對比，#為P<0.05。

2.2 細胞增殖活性對比

轉染24 h、48 h后，MTT法檢測顯示miR-125b mimics組的細胞增殖活性顯著低于miR-125b inhibitor組與NC組(P<0.05)，后兩組對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同組別THP-1細胞轉染后不同時間點的細胞增殖活性對比

注：與NC組對比，*為P<0.05；與miR-125b inhibitor組對比，#為P<0.05。

2.3 細胞凋亡率對比

轉染24 h、48 h后，流式細胞儀檢測顯示miR-125b mimics組的細胞凋亡率顯著高于miR-125b inhibitor組與NC組(P<0.05)，后兩組對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 Bak1、AKT、PI3K蛋白表達對比

轉染48 h后，Western-blot法檢測顯示miR-125b mimics組的 Bak1蛋白表達水平顯著高于miR-125b inhibitor組與NC組(P<0.05)，三組PI3K、AKT蛋白表達水平對比差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

表3 不同組別THP-1細胞轉染后不同時間點的細胞凋亡率對比

注：與NC組對比，*為P<0.05；與miR-125b inhibitor組對比，#為P<0.05。

圖1 三組 Bak1、AKT、PI3K蛋白表達對比

2.5 熒光素酶活性對比

在HEK293細胞株中，miR-125b mimic轉染48 h后可以顯著降低Bak1螢火蟲熒光素酶活性(P<0.05)，而對于含有突變型載體的Bak1螢火蟲熒光素酶活性無顯著影響(P>0.05)。見表4。

表4 不同組別HEK293細胞螢火蟲熒光素酶活性對比

注：與WT對比，*為P<0.05。

3 討論

當前我國白血病的發(fā)病率逐年上升，死亡人數(shù)也逐年增多。AML是白血病的常見類型，多發(fā)病于成年人。雖然臨床上治療AML的藥物比較多，但是治療效果均較差，五年生存率很難超過40%，為了改善AML患者的預后，深入研究AML的發(fā)病與治療機制具有重要的價值。

miRNAs是1類長約22 nts的單鏈RNA，屬內(nèi)源性非編碼小RNA，人體基因組中超過1/3的蛋白編碼基因可能受miRNAs調(diào)控，各種因素所導致的miRNAs表達異常，都可導致機體產(chǎn)生疾病。有學者研究顯示，和ALL相比，AML中有6個miRNAs表達下調(diào)，22個表達下調(diào)，其中miR-233上調(diào)最明顯，而miR-124、miR-126下調(diào)最明顯[12]。已有研究表明miRNA-125b過表達聯(lián)合染色體易位導致白血病的發(fā)生，并且miR-125b的過表達也可發(fā)生在骨髓增生異常綜合征和AML的患者中[13]。有研究發(fā)現(xiàn)miR-125b在膀胱癌細胞中低表達，外源性過表達miR-125b可以導致膀胱癌細胞周期阻滯，抑制細胞增殖及遷移[14]。本研究顯示轉染24 h、48 h后，miR-125b mimics組的細胞增殖活性顯著低于miR-125b inhibitor組與NC組，后兩組對比差異無統(tǒng)計學意義，表明miR-125b可抑制白血病細胞的增殖。也有研究顯示在慢性淋巴細胞性白血病(CLL)中，miR-125b表達顯著降低，并且miR-125b降低可以將慢性淋巴細胞性白血病進行亞型分類，也與預后有顯著相關性[15]。

AML發(fā)生的確切機制目前仍尚未完全清楚，不過也是一個多基因、多階段的疾病，其病理改變涉及代謝酶、炎癥、細胞周期、細胞凋亡的變化。miRNAs介導的轉錄后調(diào)控是一種重要的表觀遺傳學手段，于人體內(nèi)miRNAs已超過千種，調(diào)控了人體內(nèi)60%的功能基因的表達[16]。本研究顯示轉染24 h、48 h后，miR-125b mimics組的細胞凋亡率顯著高于miR-125b inhibitor組與NC組，后兩組對比差異無統(tǒng)計學意義，表明miR-125b可促進AML細胞的凋亡。有研究顯示在白血病細胞株中外源性過表達miR-22可以在體外有效的抑制白血病細胞的增殖，可以顯著延長小鼠的總體生存時間，抑制白血病的發(fā)展[17]。還有研究表明miR-125b過表達可以通過抑制下游靶基因介導膀胱癌細胞G1期阻滯，從而促使細胞生長受阻，還能抑制膀胱癌細胞的遷移和浸潤能力[18]。

miRNAs的作用方式是通過靶向作用于mRNA的3'非編碼區(qū)，使mRNA降解或者轉錄紊亂從而發(fā)揮功能。某一特定miRNA可同時作用多個靶基因，而同一個基因又可受到多個miRNA轉錄后調(diào)控，表明miRNAs發(fā)揮生物學功能具有組織學和細胞學的特異性。同時miRNAs所產(chǎn)生的生物學行為是通過調(diào)控不同的靶基因來完成的，可能是導致miRNAs功能組織特異性的主要因素。有研究顯示PI3K是miR-125b的靶基因，它可通過下調(diào)PI3KR1表達抑制下游信號而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[19]。本研究Western-blot法檢測顯示轉染48 h后miR-125b mimics組的 Bak1蛋白表達水平顯著高于miR-125b inhibitor組與NC組，三組PI3K、AKT蛋白表達水平對比差異無統(tǒng)計學意義，由此推測miR-125b可通過間接影響B(tài)ak1信號傳導實現(xiàn)對AML細胞的保護作用。當前也有研究顯示過表達miR-125a-3p能促進白血病細胞凋亡和分化，抑制細胞轉移，可能通過激活線粒體通路來誘導細胞凋亡[20]。

miR-125b在AML中可能是1個重要的抑癌性miRNA，但具體的靶基因還不明確。有研究顯示過表達miR-126可以導致白血病干細胞的長期存活，而利用熒光雙報告實驗發(fā)現(xiàn)miR-126可以直接靶向兩個重要的抑癌基因ERRF11和SPRED1，也可通過對PI3K、AKT、mTOR信號通路維持白血病干細處于靜止狀態(tài)并促進化療耐藥[21]。本研究通過生物信息學方法預測了miR-125b下游潛在的轉錄保守的靶基因，包括低氧調(diào)控、細胞周期、細胞凋亡等調(diào)控基因。特別是在細胞凋亡Bcl-2家族成員中，其功能與促凋亡家族蛋白Bak1密切相關，姜黃素可調(diào)節(jié)急性髓系白血病原代細胞和細胞系中Bak1表達而誘導調(diào)亡。也有研究表明Bak1的表達是其中降低急性白血病緩解率的最重要的因素，促進Bak1的表達可能逆轉急性白血病的病情[22]。本研究顯示miR-125b mimic轉染48 h后可以顯著降低Bak1螢火蟲熒光素酶活性，而對于含有突變型載體的Bak1螢火蟲熒光素酶活性無顯著影響，這就間接說明了在AML中Bak1是miR-125b的靶基因。也有研究發(fā)現(xiàn)miR-125b在人髓系白血病細胞中靶向調(diào)節(jié)Bak1的表達，從而致使人髓系白血病細胞惡性增殖[23]。不過miRNAs可與多種基因進行靶向調(diào)控，因此僅對個別凋亡調(diào)節(jié)蛋白進行靶基因分析可能還不夠全面，將在以后的研究中進行深入分析。

總之，過表達miR-125b可通過靶向抑制Bak1的活性，抑制人AML細胞株的增殖活性，促進細胞凋亡。